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CN105012995B - 一种含促骨愈合药物的胶原蛋白海绵及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含促骨折愈合药物的胶原蛋白海绵及其制备方法，步骤如下：1)将双膦酸盐和/或锶盐加入1kg胶原蛋白的酶解液中，胶原蛋白酶解产物与水的比例为1:9～1:8；原型药中膦酸根等效剂量为70‐140mg/kg；锶盐的剂量为100‐800mg/kg；双膦酸盐包括依替膦酸钠、氯膦酸钠、帕米膦酸钠、替鲁膦酸钠、阿仑膦酸钠、奈立膦酸钠、奥帕膦酸钠等；锶盐包括氯化锶和雷尼酸锶；2)在含有双膦酸盐和/或锶盐的胶原蛋白酶解液中加入交联剂，按40‐60U/g胶原蛋白酶解液的比例加入交联剂谷氨酰胺转氨酶，交联2‐5小时；交联剂为谷氨酰胺转氨酶；3)将步骤2)的混合液搅拌均匀，放入不锈钢盘中置于真空冷冻干燥机中，冻干10‑16小时成海绵状；4)将上述胶原蛋白海绵切割、包装密封、钴60照射灭菌。

Description

一种含促骨愈合药物的胶原蛋白海绵及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种促骨折愈合药物的胶原蛋白海绵及其制备方法，属于的医疗器材技术领域。

背景技术

骨质疏松(Osteoporosis,OP)是以骨量减少，骨组织微观结构退化，致使骨强度下降，骨脆性增加以及骨折风险增大为特征的一种全身性骨骼系统疾病。骨重建是一个骨组织自我更新的过程：破骨细胞不断吸收旧骨，而成骨细胞则不断形成新骨补充骨吸收部分。当机体骨骼发育成熟后，破骨细胞在骨重建过程中发挥重要作用。若破骨细胞活性增强或量增多，可以导致骨吸收增加，骨重建失衡，导致很多骨骼系统疾病的发生，如骨质疏松症。骨质疏松最常见的并发症是骨折，常见部位是髋部，椎体和桡骨远端。妇女在进入绝经期后，骨量丢失明显，如无适当预防和治疗，骨质疏松将不可避免地造成桡骨、脊柱和髋部等处的骨折。随着人口老龄化和人均寿命的延长，骨质疏松性骨折发生率全球每年平均以大于1％的速度递增，因此研究更多有效、简便的辅助治疗骨质疏松性骨折的手段以满足不同人群的需要是目前的重点任务之一。

双膦酸盐(Bisphosphonate,BPs)药物是过去30年发展起来的一类新药物，主要用于治疗和预防恶性肿瘤骨转移及骨代谢性疾病，如骨质疏松症和Pagets病。根据药物作用强度或上市时间，人们将BPs分为三代，第一代系不含氮的BPs，主要是七十、八十年代的产品。第二代BPs抗骨质吸收的作用强度明显优于第一代产品，其结构中以含氨基为主要特点。第三代BPs是最新一代药物，于上世纪末和本世纪初上市，抗骨吸收作用更强，临床应用也更方便，伊班膦酸钠是其代表产品。

伊班膦酸钠作为强效破骨细胞抑制剂，能特异地与骨质中的羟基磷灰石结合，不但能抑制破骨细胞活性，又能诱导破骨细胞凋亡，这是伊班膦酸钠的直接作用。此外，伊班膦酸钠还可以作用于成骨细胞，通过后者释放一种或几种破骨细胞更新抑制因子，进而缩短破骨细胞寿命，减少破骨细胞数量。因此，伊班膦酸钠全身应用不仅可治疗和预防骨质疏松症，局部应用于骨折处可辅助促进骨折愈合，特别是由于骨质疏松症所引起骨折。另外，伊班膦酸钠相关药物治疗存在一定副作用，少数病人可出现体温升高，有时也会出现类似流感的症状。个别病例还会出现胃肠道不适，但若将此药物局部应用可大幅降低毒副作用。

锶(Strontium,Sr)是骨骼的重要组成部分，其化学结构与钙相似，锶离子在骨质中保持一定的比例可以维持骨质的正常功能，是人体骨中必须的元素之一。β-Catenin是wnt通路中的重要因子。锶可通过调控wnt通路促进成骨细胞生长和抑制破骨细胞活性。另外，锶盐可以增加碱性磷酸酶(ALP)的活性及骨胶原的合成。动物实验也认为锶盐在或体内可减少骨吸收同时增加骨形成，促进骨量和骨强度增加。同时锶盐可以在不影响内环境矿物质稳定的前提下，改善骨小梁的微结构。因此，将锶盐应用于局部骨折处，不仅增加药物浓度促进其愈合，而且可减少全身性毒副作用。

胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，具有特殊的机械性能和生物特性，起着支撑器官、保护机体的功能。随着制备工艺的改进和修饰技术的发展，胶原蛋白已经成为一种性能优异、应用广泛的生物材料，其可应用于烧伤敷料、创伤填充、体内止血以及组织工程修复中。

发明内容

本发明的目的是提供一种促骨折愈合药物的胶原蛋白海绵及其制备方法，利用胶原蛋白海绵填塞于骨折处，一方面起填塞止血作用，另一方面利用胶原蛋白海绵的特殊结构起药物载体作用，负载双膦酸盐或锶盐作用于骨折处，促进骨折愈合，特别是在骨质疏松症所引发骨折中。

本发明提供一种含促骨愈合药物的胶原蛋白海绵的制备方法，其含药胶原蛋白海绵产品可促进骨折愈合特别是应用在骨质疏松症所引发的骨折中。

本发明采用如下技术方案：本发明的一种含促骨折愈合药物的胶原蛋白海绵，组分为：胶原蛋白的酶解液、双膦酸盐或锶盐、交联剂；制作方法是：将双膦酸盐或锶盐加入到胶原蛋白的酶解液中，配比为胶原蛋白的酶解液1kg，双膦酸盐膦酸根的等效剂量为70-140mg/kg，锶盐的剂量为100-800mg/kg，并按每克胶原蛋白的酶解液加入40-60U交联剂谷氨酰胺转氨酶；其中胶原蛋白酶解产物与水的比例为1:9～1:8；双膦酸盐包括依替膦酸钠、氯膦酸钠、帕米膦酸钠、替鲁膦酸钠、阿仑膦酸钠、奈立膦酸钠、奥帕膦酸钠、利塞膦酸钠和伊班膦酸钠；锶盐包括氯化锶和雷尼酸锶。

优选地，制作方法中：胶原蛋白的酶解液1kg，原型药中膦酸根等效剂量为70-140mg/kg，氯化锶的剂量为100-200mg/kg，雷尼酸锶的剂量为300-600mg/kg。

本发明的一种含促骨折愈合药物的胶原蛋白海绵的制备方法，步骤如下：

1)将双膦酸盐或锶盐加入1kg胶原蛋白的酶解液中，其中胶原蛋白酶解产物与水的比例为1:9～1:8；原型药中膦酸根等效剂量为70-140mg/kg；锶盐的剂量为100-800mg/kg；其中双膦酸盐包括依替膦酸钠、氯膦酸钠、帕米膦酸钠、替鲁膦酸钠、阿仑膦酸钠、奈立膦酸钠、奥帕膦酸钠、利塞膦酸钠和伊班膦酸钠；锶盐包括氯化锶和雷尼酸锶；

2)在含有双膦酸盐或锶盐的胶原蛋白酶解液中加入交联剂，按40-60U/g胶原蛋白酶解液的比例加入交联剂谷氨酰胺转氨酶，交联2-5小时；其中交联剂为谷氨酰胺转氨酶；

3)将步骤2)的混合液搅拌均匀，放入不锈钢盘中，把不锈钢盘置于真空冷冻干燥机中，冻干10-16小时，经冷冻干燥成海绵状；

4)将含有双膦酸盐或锶盐的胶原蛋白海绵切割、包装密封、钴60照射灭菌。

所述的双膦酸盐为第一代双膦酸盐依替膦酸钠。

所述的双膦酸盐为第二代双膦酸盐氯膦酸钠、帕米膦酸钠和替鲁膦酸钠。

所述的双膦酸盐为第三代双膦酸盐阿仑膦酸钠、奈立膦酸钠、奥帕膦酸钠、利塞膦酸钠和伊班膦酸钠。

优选地，所述的促骨折愈合药物为双膦酸盐或锶盐组合，其比例为：胶原蛋白的酶解液1kg，原型药中膦酸根等效剂量为70-140mg/kg，氯化锶的剂量为100-200mg/kg，雷尼酸锶的剂量为300-600mg/kg。

本发明的有益效果：

本发明在单纯胶原蛋白海绵的基础上，利用胶原蛋白海绵的药物载体作用，提供了一个含促骨愈合药物的胶原蛋白海绵的新组合材料。

经实验表明，由于组合材料中的药物作用，含药胶原蛋白海绵作用于骨折处，不仅可有效止血，且可大幅促进骨折愈合，这是单纯胶原蛋白海绵敷料所不能及的。并且在临床使用病例中充分说明其疗效确切。

具体实施方式

胶原蛋白酶解液的制取：

将去脂肪清理干净的新鲜猪皮或牛皮或结缔组织放入不锈钢桶中，按照固液比1:30-1:40的比例，加入0.01-0.03mol/L的氢氧化钠水溶液，于6-8℃浸泡1-2小时，过滤，备用。在上述预处理材料中加入相当于材料质量6-8倍的无水乙醚或者丙酮，于35-40℃回流5-8小时，之后用蒸馏水冲至无异味，备用。将上述处理后的材料浸入0.6-0.7mol/L冰醋酸和600-700mg/L胃蛋白酶的混合液中，持续搅拌25-30小时。对上述混合物采用渐进式超声波处理，先使用100-200W超声处理30分钟，再使用200-300W超声处理30分钟，最后使用300-400W超声处理1小时。超声处理后加入2-3％的H2O2溶液，混合静置2-4小时，调节pH至5.0，离心。去上清液，加入NaCl，搅拌20-30小时，离心，沉淀物加入0.6-0.7mol/L冰醋酸溶解，离心，取上清液，调节pH至7.5，加入NaCl，搅拌20-30小时，离心，将沉淀物溶解于0.6-0.7mol/L冰醋酸，先以0.6-0.7mol/L冰醋酸为透析外液透析2次，每次4小时，再以蒸馏水为透析外液透析5-7次，每次4小时，至外液检测不到氯离子，得到胶原蛋白酶解液，其中胶原蛋白酶解产物与水的比例为1:9～1:8。

实施例1：

含第一代双膦酸盐的胶原蛋白海绵的制取：

将第一代双膦酸盐(如依替膦酸钠)加入到制取好的胶原蛋白酶解液中，并按60U/g胶原的比例加入交联剂谷氨酰胺转氨酶，交联2-5小时。搅拌均匀，放入不锈钢盘中。

把不锈钢盘置于真空冷冻干燥机中，冻干10-16小时。取出冻干蛋白海绵，按临床需要切割成不同规格的产品。内包装密封。将包装密封的含第一代双膦酸盐的胶原蛋白海绵用钴60照射灭菌。灭菌后的产品供临床实验使用。其特征在于保证胶原蛋白海绵用于临床时，原型药中膦酸根的最佳等效剂量为70-140mg/kg。当给药剂量小于最佳剂量时，其局部释放药物浓度达不到所需治疗浓度；当给药剂量大于最佳剂量时，其局部释放药物浓度过高可能会产生毒性作用。

实施例2：

含第二代双膦酸盐的胶原蛋白海绵的制取：

将第二代双膦酸盐(如氯膦酸钠、帕米膦酸钠和替鲁膦酸钠)加入到制取好的胶原蛋白酶解液中，并按60U/g胶原的比例加入交联剂谷氨酰胺转氨酶，交联2-5小时。搅拌均匀，放入不锈钢盘中。

把不锈钢盘置于真空冷冻干燥机中，冻干10-16小时。取出冻干蛋白海绵，按临床需要切割成不同规格的产品。内包装密封。将包装密封的含第二代双膦酸盐的胶原蛋白海绵用钴60照射灭菌。灭菌后的产品供临床实验使用。其特征在于保证胶原蛋白海绵用于临床时，原型药中膦酸根的最佳等效剂量为70-140mg/kg。当给药剂量小于最佳剂量时，其局部释放药物浓度达不到所需治疗浓度；当给药剂量大于最佳剂量时，其局部释放药物浓度过高可能会产生毒性作用。

实施例3：

含第三代双膦酸盐的胶原蛋白海绵的制取

将第三代双膦酸盐(如阿仑膦酸钠、奈立膦酸钠、奥帕膦酸钠、利塞膦酸钠和伊班膦酸钠)加入到制取好的胶原蛋白酶解液中，并按60U/g胶原的比例加入交联剂谷氨酰胺转氨酶，交联2-5小时。搅拌均匀，放入不锈钢盘中。

把不锈钢盘置于真空冷冻干燥机中，冻干10-16小时。取出冻干蛋白海绵，按临床需要切割成不同规格的产品。内包装密封。将包装密封的含第三代双膦酸盐的胶原蛋白海绵用钴60照射灭菌。灭菌后的产品供临床实验使用。其特征在于保证胶原蛋白海绵用于临床时，原型药中膦酸根的最佳等效剂量为70-140mg/kg。当给药剂量小于最佳剂量时，其局部释放药物浓度达不到所需治疗浓度；当给药剂量大于最佳剂量时，其局部释放药物浓度过高可能会产生毒性作用。

实施例4：

含氯化锶的胶原蛋白海绵的制取：

将氯化锶加入到制取好的胶原蛋白酶解液中，并按60U/g胶原的比例加入交联剂谷氨酰胺转氨酶，交联2-5小时。搅拌均匀，放入不锈钢盘中。

把不锈钢盘置于真空冷冻干燥机中，冻干10-16小时。取出冻干蛋白海绵，按临床需要切割成不同规格的产品。内包装密封。将包装密封的含氯化锶的胶原蛋白海绵用钴60照射灭菌。灭菌后的产品供临床实验使用。其特征在于保证胶原蛋白海绵用于临床时，其中氯化锶的最佳剂量为100-200mg/kg。当给药剂量小于最佳剂量时，其局部释放药物浓度达不到所需治疗浓度；当给药剂量大于最佳剂量时，其局部释放药物浓度过高可能会产生毒性作用。

实施例5：含雷尼酸锶胶原蛋白海绵的制取：

将雷尼酸锶加入到制取好的胶原蛋白酶解液中，并按60U/g胶原的比例加入交联剂谷氨酰胺转氨酶，交联2-5小时。搅拌均匀，放入不锈钢盘中。

把不锈钢盘置于真空冷冻干燥机中，冻干10-16小时。取出冻干蛋白海绵，按临床需要切割成不同规格的产品。内包装密封。将包装密封的含雷尼酸锶的胶原蛋白海绵用钴60照射灭菌。灭菌后的产品供临床实验使用。其特征在于保证胶原蛋白海绵用于临床时，其中雷尼酸锶的最佳剂量为300-600mg/kg。当给药剂量小于最佳剂量时，其局部释放药物浓度达不到所需治疗浓度；当给药剂量大于最佳剂量时，其局部释放药物浓度过高可能会产生毒性作用。

实施例6：

含双膦酸盐和锶盐胶原蛋白海绵的制取：

将双膦酸盐(包括依替膦酸钠、氯膦酸钠、帕米膦酸钠、替鲁膦酸钠、阿仑膦酸钠、奈立膦酸钠、奥帕膦酸钠、利塞膦酸钠和伊班膦酸钠等)和锶盐(包括氯化锶和雷尼酸锶等)加入胶原蛋白的酶解液中，并按60U/g胶原的比例加入交联剂谷氨酰胺转氨酶，交联2-5小时。搅拌均匀，放入不锈钢盘中。

把不锈钢盘置于真空冷冻干燥机中，冻干10-16小时。取出冻干蛋白海绵，按临床需要切割成不同规格的产品。内包装密封。将包装密封的含双膦酸盐和锶盐的胶原蛋白海绵用钴60照射灭菌。灭菌后的产品供临床实验使用。其特征在于保证胶原蛋白海绵用于临床时，原型药中膦酸根的最佳等效剂量为70-140mg/kg，氯化锶的最佳剂量为100-200mg/kg，雷尼酸锶的最佳剂量为300-600mg/kg。当给药剂量小于最佳剂量时，其局部释放药物浓度达不到所需治疗浓度；当给药剂量大于最佳剂量时，其局部释放药物浓度过高可能会产生毒性作用。

含药胶原蛋白海绵促进骨折愈合的动物实验：

1.材料与方法

1.1实验动物：采用新西兰兔，雄性，重量约2-3kg(12-16周龄)

1.2实验分组及材料：分为空白组(Control)、胶原蛋白海绵组

(CS)、伊班膦酸钠组(0.1mg/kg IB)、小剂量伊班膦酸钠+胶原蛋白海绵组(SIB+CS，0.125mg IB)、中剂量伊班膦酸钠+胶原蛋白海绵组(MIB+CS，0.25mg IB)和大剂量伊班膦酸钠+胶原蛋白海绵组(LIB+CS，0.5mg IB)，共6组。每组10只实验动物，共70只。

1.3材料制备：

SIB+CS组材料制备：将1mg/ml IB 125ul加入到600ml胶原蛋白酶解液中，制备50*25*5mm胶原蛋白海绵；

MIB+CS组材料制备：将1mg/ml IB 250ul加入到600ml胶原蛋白酶解液中，制备50*25*5mm胶原蛋白海绵；

LIB+CS组材料制备：将1mg/ml IB 500ul加入到600ml胶原蛋白酶解液中，制备50*25*5mm胶原蛋白海绵；

2.实验方法：

将雄性新西兰兔予以戊巴比妥钠(3％，1mg/kg)耳缘静脉注射麻醉，麻醉成功后，用8％硫化钠脱毛术区皮肤，消毒，将动物背卧位固定并消毒铺无菌巾单，右腿股骨远端髌旁纵行切口，牵开髌骨暴露股骨远端内外侧髁，从内外髁之间通过电钻逆行打入2mm克氏针1根，克氏针经髓腔自股骨近侧端穿出皮肤，截断远端克氏针保证远端埋入膝关节面下，膝盖复位。取股骨远端外侧切口，沿肌间隙暴露股骨，充分保护周围肌肉血管等软组织，牙钻锯断。Control组与IB组不做任何处理，分别将CS组、SIB+CS组、MIB+CS组及LIB+CS组制备材料置入动物骨折处，无菌生理盐水冲洗切口及皮肤并用5-0尼龙线缝合，Control组及IB组在术后分别给予生理盐水(0.1ml/kg)和伊班膦酸钠(0.1ml/kg)。术后所有动物3天内每天肌肉注射丁丙诺啡(0.05mg/kg)两次及环丙沙星(10mg/kg)一次。所有动物均正常喂养(避光安静,温度20-26℃，湿度低于80％)。手术当天X线拍片査看术后骨折对位对线情况。并在2周，4周，每次处死1/2的新西兰兔，进行检测

3.实验结果：

3.1第2周及第4周各组骨痂横切面积变化如下表所示，

在第二周及第四周时，不同剂量含IB胶原蛋白海绵组骨痂横切面积较Control、GS及IB组均有明显增加。其中中剂量组变化最明显。

表1第2周及第4周各组骨痂横切面积变化(CSA,mm2)

a：control组与IB组相比，p<0.001

b：control组与SIB+GS组相比，p<0.001

c：control组与MIB+GS组相比，p<0.001

d：control组与LIB+GS组相比，P<0.001

e：GS组与SIB+GS组相比，P<0.001

f：GS组与MIB+GS组相比，p<0.001

g：GS组与LIB+GS组相比，P<0.001

h：GS组与IB组相比，P<0.001

i：SIB+GS组与IB组相比，p<0.001

j：MIB+GS组与IB组相比，p<0.001

k：LIB+GS组与IB组相比，p<0.001

3.2第二周及第四周兔胫骨骨折处三点弯曲受力实验：

如表2及表3所示，在第二周及第四周时，进行兔胫骨骨折处三点弯曲受力实验，发现中剂量组表现最佳。

表2第2周兔胫骨骨折处三点弯曲受力实验

表3第4周兔胫骨骨折处三点弯曲受力实验

a：control组与IB组相比，p<0.05

b：control组与SIB+GS组相比，p<0.05

c：control组与MIB+GS组相比，p<0.05

d：control组与LIB+GS组相比，P<0.05

e：GS组与SIB+GS组相比，P<0.05

f：GS组与MIB+GS组相比，p<0.05

g：GS组与LIB+GS组相比，P<0.05

h：GS组与IB组相比，P<0.05

i：SIB+GS组与IB组相比，p<0.05

j：MIB+GS组与IB组相比，p<0.05

k：LIB+GS组与IB组相比，p<0.05

4.结论：

通过上述动物实验发现，中剂量伊班膦酸钠加入胶原蛋白海绵中，其促进骨折愈合效果最好。

含药胶原蛋白海绵促进骨折愈合的临床试验：

1、材料与方法

1.1临床资料：60例骨质疏松性骨折患者，随机分为两组，即实验组和对照组，各30例。采用双盲法给予含双膦酸盐(伊班膦酸钠300mg/kg)和锶盐(氯化锶200mg/kg)胶原蛋白酶解液所制成的胶原蛋白海绵和含生理盐水胶原蛋白海绵于骨折处。两组性别、年龄情况比较。差异均无统计学意义(P>0.05)。(表1)

表1两组患者的性别、年龄分布(n＝30)

1.2材料来源：

采用实施例6含药胶原蛋白海绵。

1.3研究方法：

手术暴露骨折患处，在骨折断端处复位，实验组在断端处贴附含双膦酸盐或锶盐的胶原蛋白海绵，对照组贴附含生理盐水的胶原蛋白海绵。石膏外固定，分别于2、4周进行X光检测，观察骨痂生长情况。

1.4统计学分析：

用SPSS19.0软件进行统计学分析，数据以(x±s)表示，采用t检验，以(P<0.05)为差异有统计学意义。

2、结果：

影像学评分比较：2周时，实验组骨性骨痂呈云雾状，软骨骨痂基本消失，骨折线模糊。对照组局部疼痛及纵向叩击痛症状稍明显，未达到临床愈合。实验组与对照组患者骨折复位石膏外固定术后2周时Lane-Sandhu X线评分结果差异有统计学意义(P<0.05)，4周时骨痂生长评分结果与对照组相比差异有显著统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2骨质疏松实验与对照组患者骨痂生长程度评分结果(n＝30，x±s)

结果表明实验组患者骨折端骨痂生长的速度、细胞数量及骨质量优于对照组，含双膦酸盐和锶盐胶原蛋白海绵可促进骨质疏松性骨折愈合，加快愈合过程。

Claims (5)

1.一种含促骨折愈合药物的胶原蛋白海绵，组分为：胶原蛋白的酶解液、双膦酸盐或锶盐、交联剂；制作方法是：将双膦酸盐或锶盐加入到胶原蛋白的酶解液中，配比为胶原蛋白的酶解液1kg，原型药中膦酸根等效剂量为70‐140mg/kg，氯化锶的剂量为100‐200mg/kg，雷尼酸锶的剂量为300‐600mg/kg，并按每克胶原蛋白的酶解液加入40‐60U交联剂谷氨酰胺转氨酶；其中胶原蛋白酶解产物与水的比例为1:9～1:8；双膦酸盐包括依替膦酸钠、氯膦酸钠、帕米膦酸钠、替鲁膦酸钠、阿仑膦酸钠、奈立膦酸钠、奥帕膦酸钠、利塞膦酸钠和伊班膦酸钠；锶盐包括氯化锶和雷尼酸锶。

2.一种含促骨折愈合药物的胶原蛋白海绵的制备方法，步骤如下：

1)将双膦酸盐或锶盐加入1kg胶原蛋白的酶解液中，其中胶原蛋白酶解产物与水的比例为1:9～1:8；原型药中膦酸根等效剂量为70‐140mg/kg；锶盐的剂量为100‐800mg/kg；其中双膦酸盐包括依替膦酸钠、氯膦酸钠、帕米膦酸钠、替鲁膦酸钠、阿仑膦酸钠、奈立膦酸钠、奥帕膦酸钠、利塞膦酸钠和伊班膦酸钠；所述的促骨折愈合药物为双膦酸盐或锶盐，其比例为：胶原蛋白的酶解液1kg，原型药中膦酸根等效剂量为70‐140mg/kg，氯化锶的剂量为100‐200mg/kg，雷尼酸锶的剂量为300‐600mg/kg，锶盐包括氯化锶和雷尼酸锶；

2)在含有双膦酸盐或锶盐的胶原蛋白酶解液中加入交联剂，按40-60U/g胶原蛋白酶解液的比例加入交联剂谷氨酰胺转氨酶，交联2-5小时；其中交联剂为谷氨酰胺转氨酶；

3)将步骤2)的混合液搅拌均匀，放入不锈钢盘中，把不锈钢盘置于真空冷冻干燥机中，冻干10-16小时，经冷冻干燥成海绵状；

4)将含有双膦酸盐或锶盐的胶原蛋白海绵切割、包装密封、钴60照射灭菌。

3.根据权利要求2所述的含有双膦酸盐或锶盐的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于：所述的双膦酸盐为第一代双膦酸盐依替膦酸钠。

4.根据权利要求2所述的含有双膦酸盐或锶盐的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于：所述的双膦酸盐为第二代双膦酸盐氯膦酸钠、帕米膦酸钠和替鲁膦酸钠。

5.根据权利要求2所述的含有双膦酸盐或锶盐的胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于：所述的双膦酸盐为第三代双膦酸盐阿仑膦酸钠、奈立膦酸钠、奥帕膦酸钠、利塞膦酸钠和伊班膦酸钠。

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