CN111484977B - 重编程产生功能性去甲肾上腺素能神经元的方法 - Google Patents

本发明涉及一种重编程产生功能性去甲肾上腺素能神经元的方法。本发明的方法通过在非神经元细胞中过表达若干个转录因子，将已经分化的体细胞在体外诱导成了具有功能的去甲肾上腺素能神经元。利用本发明的方法产生的去甲肾上腺素能神经元，移植到体内能够存活，并可用于开发多种神经系统疾病的预防、改善或治疗药物。

重编程产生功能性去甲肾上腺素能神经元的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种重编程产生功能性去甲肾上腺素能神经元的方法。

背景技术

去甲肾上腺素能(NA)神经元是一类重要的调质类神经元。这类神经元参与觉醒、注意力、情绪、感觉(比如痛觉)等多种生理活动的调控，其功能异常也与很多神经系统疾病相关。研究报道表明，NA神经元在帕金森氏症(PD)以及阿尔兹海默症(AD)这两大类神经退行性疾病病人的脑中都有大量的丢失。用健康的NA神经元取代在PD或者AD病人脑中死亡的NA神经元将是治疗这些疾病的很有前景的手段。

最近几年兴起的直接重编程技术，即将一种终末分化的细胞直接转分化成为另一种终末分化的细胞，在定向诱导神经元方面已经取得了一系列重要进展。通过直接转分化获得的神经元主要包括多巴胺能神经元、运动神经元、纹状体多棘神经元、外周兴奋性的感觉神经元、五羟色胺能神经元、前脑抑制性的GABA能神经元等等。这些不同类型神经元细胞的获得为相关疾病的细胞替代治疗提供了重要的细胞来源。但是，通过直接重编程在体外获得去甲肾上腺素能神经元在本领域中目前还未见报道。

直接重编程的过程并不经过干细胞增殖阶段，而且诱导的过程与干细胞诱导神经分化相比更加简单且周期更短。因此，如果能够在体外通过直接重编程得到NA神经元，这对于神经系统疾病如神经退行性疾病的细胞治疗将具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重编程产生功能性去甲肾上腺素能神经元的方法。

在本发明的第一方面，提供一种产生去甲肾上腺素能神经元的方法，包括在非神经元细胞中表达(包括重组表达或过表达)外源的以下转录因子：Ascl1，Phox2b，Gata3，Hand2；以及选自AP-2α和Nurr1之一或两种；其中，所述Ascl1，Phox2b，Gata3，Hand2，AP-2α或Nurr1还包括其同源物、类似物或变体。

在一个优选例中，还在细胞中表达外源的以下转录因子：Phox2a，或其同源物、类似物或变体。

在另一优选例中，所述的非神经元细胞为体细胞。

在另一优选例中，所述的体细胞包括(但可能不限于)：成纤维细胞(包括胚胎成纤维细胞)，星形胶质细胞，上皮细胞，血液细胞，组织或器官来源的细胞。

在另一优选例中，所述的细胞是哺乳动物细胞；更佳地，所述的细胞是人源的细胞。

在另一优选例中，在非神经元细胞中表达所述外源的转录因子的方法是：(a)提供细胞；(b)用表达载体将所述的转录因子转入(a)的细胞中，或通过蛋白转染将所述的转录因子转入(a)的细胞中；(c)培养(b)获得的细胞。

在另一优选例中，所述的表达载体为病毒载体或非病毒载体，包括但不限于：慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体，逆转录病毒载体，非病毒的质粒。

在另一优选例中，所述的Gata3的同源物或类似物为：Gata2；或所述的AP-2α的同源物或类似物为：AP-2β。

在本发明的另一方面，提供一种去甲肾上腺素能神经元或其培养物，其由前面任一所述的方法获得。

在一个优选例中，所述去甲肾上腺素能神经元具有如下一种或多种性能：1)释放去甲肾上腺素；2)表达去甲肾上腺素能神经元的标志分子Dbh，Th；3)表达去甲肾上腺素能神经元的标志分子Ddc，Vmat2，Slc6a2，Galanin，Npy，Htr3a，Ret；4)表达去甲肾上腺素能神经元的标志分子Th、Dbh、Vmat2、ddc、Net、Map2、Npy、Gal、Ret；5)表达去甲肾上腺素能神经元的标志分子Synapsin I、Ddc、Vmat2、Net、Galanin、Npy；6)具备神经元的基本电生理特征，包括：膜阻抗、静息膜电位、在去极化的刺激下能够产生动作电位，并且能够记录到由于钠通道开放而产生的钠电流，能够接受其他细胞的输入并产生输出；7)能够与靶细胞或者靶器官建立突触联系并支配其活动。

在本发明的另一方面，提供所述的去甲肾上腺素能神经元或其培养物的用途，用于：制备预防、改善或治疗神经系统疾病(主要包括精神类疾病和神经退行性疾病，如神经损伤、孤独症、抑郁症、精神分裂症、药物成瘾、帕金森氏症、阿尔兹海默症和脊髓损伤等)的药物；或作为体外模型，进行神经系统疾病的模拟及其药物的筛选；或制备体内细胞移植的组合物。

在另一优选例中，所述的神经系统疾病及其药物的研究包括：研究药物运输、药物代谢、神经系统形成；或神经元毒性测试、筛选神经元毒性物质、筛选调节神经元功能的物质。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，所述组合物含有：所述的去甲肾上腺素能神经元或其培养物，以及药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于产生去甲肾上腺素能神经元的转录因子组合；包括以下转录因子：Ascl1，Phox2b，Gata3，Hand2；以及选自AP-2α和Nurr1之一或两种；其中，所述Ascl1，Phox2b，Gata3，Hand2，AP-2α或Nurr1还包括其同源物、类似物或变体。较佳地，其中还包括转录因子：Phox2a，或其同源物、类似物或变体。

在本发明的另一方面，提供所述的转录因子组合的用途，用于引入非神经元细胞，将其诱导为去甲肾上腺素能神经元。

在本发明的另一方面，提供一种用于产生去甲肾上腺素能神经元的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的转录因子组合，或所述转录因子的编码基因、表达盒或表达载体。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自以下的一种或多种：用于过表达转录因子或其同源物、类似物或变体的细胞；表达转录因子或其同源物、类似物或变体的表达载体；转化或转染试剂；细胞培养基；生长因子或添加物，包括：B-27、PS、BDNF、GDNF或FSK。

在另一优选例中，所述的细胞培养基包括但不限于：DMEM、MEM、RPMI、Neuronalbasal或Fischers；较佳地，所述的DMEM选自：DMEM/F12，Advanced DMEM/F12。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、慢病毒载体的构建以及慢病毒包装。

图2、分离的原代细胞纯度鉴定。

图3、病毒感染原代细胞进行诱导并用高效液相进行因子筛选。A、操作流程的示意图；B、8个候选的转录因子各自的作用分析；C、进一步减少部分转录因子后的诱导效果；D、不同组合的转录因子的诱导效果。

图4、免疫细胞化学染色(A)以及实时荧光定量PCR(B)鉴定诱导的细胞。

图5、单细胞膜片钳记录鉴定诱导的细胞。

图6、诱导的去甲肾上腺素能神经元与心肌细胞共培养。

图7、用转录因子Gata3的同家族转录因子Gata2进行诱导可以得到与Gata3类似的效果。

图8、用转录因子AP-2α的同家族转录因子AP-2β进行诱导可以得到与AP-2α类似的效果(A)及统计图(B)。

图9A～I、小鼠胚胎成纤维细胞也能够被诱导成为功能性的去甲肾上腺素能神经元。

图10A～I、诱导的去甲肾上腺素能神经元的移植。

图11A～I、人包皮成纤维细胞也能够被诱导成为功能性的去甲肾上腺素能神经元。

具体实施方式

本发明人经过广泛的研究，通过在非神经元细胞(较佳地为体细胞)中过表达若干个转录因子，将已经分化的体细胞在体外诱导成了具有功能的去甲肾上腺素能(NA)神经元。所述的转录因子组合包括Ascl1、Phox2b、Phox2a、AP-2α、Gata3、Hand2以及Nurr1的组合以及在此基础上减1～2个转录因子的组合。利用本发明的方法产生的去甲肾上腺素能神经元，移植到体内能够存活，并可用于开发多种神经系统疾病的预防、改善或治疗药物。

术语

如本文所用，除非另外说明，所述的“细胞”或“用于过表达转录因子的细胞”是指多种类的非神经元细胞，只要其能够在转入所述的转录因子后转分化为去甲肾上腺素能神经元。较佳地，所述的细胞是哺乳动物体细胞；例如，所述的细胞是星形胶质细胞、上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞、血液细胞、神经细胞、胚胎细胞、组织或器官来源的细胞。相对于同一个体，尽管有不同的体细胞种类，但其体细胞的基因组序列均是相同的、其主要组成部分也基本相同，这就使得多种体细胞可用于本申请，只要其能够在转入所述的转录因子后产生去甲肾上腺素能神经元。作为本发明的优选方式，所述细胞为星形胶质细胞或成纤维细胞。

如本文所用，所述的“过表达”是指细胞内转录因子的含量(如表达量)超过初始细胞(未转入该外源基因的细胞)的水平；如与初始细胞相比，其含量高20％，较佳地高50％；更佳地高100％以上，如高200％，300％...500％或更高。一种“过表达”的情形是将外源的转录因子的编码基因转入细胞中且发生表达。

如本文所用，所述的“哺乳动物”是脊索动物门(Chordata)脊椎动物亚门(Vertebrata)哺乳纲(Mammalia)的动物。本发明所述的哺乳动物包括人，也包括非人哺乳动物。所述的非人哺乳动物例如是小鼠、大鼠、兔、狗、兔、猿猴、猪、牛、羊、马等等。不管是非人哺乳动物还是人，在基因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发病机制等方面都非常接近。在进化过程中，一些关键的细胞功能或者调控通路在不同的物种之间是保守的，比如细胞增殖、凋亡的信号通路在哺乳动物中基本一致。细胞的衰老途径也是一个保守的调控机制。

转录因子及用途

本发明人应用了包括Ascl1、Phox2b、Phox2a、AP-2α、Gata3、Hand2以及Nurr1的转录因子组合以及在此基础上减1～2个的转录因子组合。所述的转录因子以及它们的GenBank登录号如表1。

表1

因此，本发明提供了一种转录因子组合，其包括Ascl1，Phox2b，Gata3，Hand2；以及选自AP-2α和Nurr1之一或两种。较佳地，所述的转录因子组合还包括转录因子Phox2a。

作为本发明的优选方式，所述的转录因子组合包括五个转录因子：Ascl1，Phox2b，Gata3，Hand2和AP-2α；或Ascl1，Phox2b，Gata3，Hand2和Nurr1。它们在转入细胞后可产生大量的去甲肾上腺素能神经元。

在本发明中，术语“转录因子”指具有表1中所示序列的多肽。该术语还包括具有与表1中所示序列的多肽相同功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(如1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(如20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括表1中所示序列的多肽的活性片段和活性衍生物。所述变异形式具备一个前提，即它们保留了全长的表1所示转录因子的功能。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体等。本发明还提供了其他多肽，如包含表1中所示序列的多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了表1中所示序列的多肽的可溶性片段，只要它们保留了全长的表1所示转录因子的功能。

发明还提供表1所示转录因子的类似物。这些类似物与天然转录因子的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

编码所述转录因子的基因可以是包括编码此转录因子的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的转录因子编码基因杂交且两个序列之间具有至少70％，更佳地至少80％，更佳地至少85％，更佳地至少90％，更佳地至少95％，更佳地至少98％相同性的变异体。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述转录因子多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

在本发明的提示下，所述的转录因子或其编码基因的变异体或衍生物是本领域人员易于获得和应用的。

编码所述的转录因子的基因序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

基于本发明的新发现，还提供了一种试剂盒，其中含有制备本发明所述的去甲肾上腺素能神经元的原料或试剂。

作为本发明的一种实施方式，提供一种用于转分化产生去甲肾上腺素能神经元的试剂盒，所述试剂盒中含有以上所述的转录因子组合。

作为本发明的一种实施方式，提供一种用于转分化产生去甲肾上腺素能神经元的试剂盒，所述试剂盒中含有一种或多种表达载体(如病毒)，所述的表达载体可分别或同时表达以上转录因子组合中的转录因子。

更优选的，所述的试剂盒中还含有选自以下的一种或多种：用于过表达转录因子或其同源物、类似物或变体的细胞；表达转录因子或其同源物、类似物或变体的表达载体；转化或转染试剂；细胞培养基；生长因子或添加物，包括：B-27、PS、BDNF、GDNF或FSK。更优选的，所述的试剂盒中还含有使用说明书。

培养方法

神经细胞的定向分化的难点在于：①定向分化效率低；②分化的目的细胞纯度低，难于富集；③分化的细胞的真实性。本发明人针对这些难题，对去甲肾上腺素能神经元的转分化进行了深入探索和优化，成功获得含高比例的去甲肾上腺素能神经元的群体，并通过分析确证了所获得的神经元细胞的真实性。

本发明公开了诱导非神经元细胞转分化为去甲肾上腺素能神经元的方法，包括：在非神经元细胞中表达转录因子：Ascl1，Phox2b，Gata3，Hand2；以及选自AP-2α和Nurr1之一或两种；培养该细胞，从而所述非神经元细胞转分化为去甲肾上腺素能神经元。

使细胞过表达外源基因(在本发明中为转录因子)的方法是本领域技术人员所熟知的。编码转录因子的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中，或也可通过蛋白转染将所述的转录因子转入细胞中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的病毒(如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒)、细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定表达，任何质粒和载体都可以用。包含编码转录因子的多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化细胞，以使其能够表达所述的转录因子。

如前所述，可将所述的转录因子的编码基因引入到细胞中，使得细胞内过表达所述的转录因子。另外，也可将转录因子蛋白外源表达后，与细胞共培养而使得转录因子蛋白进入到细胞内。一种可选择的方式例如：将转录因子蛋白与细胞穿透肽融合，由细胞穿透肽介导进入到细胞中。所述的“细胞穿透肽”是指一类具有细胞穿透作用的多肽，其自身或其与其它蛋白的融合蛋白可通过细胞膜进入到细胞内。所述的细胞穿透肽包括：反式激活蛋白(TAT)、Penetratin、基于信号序列的肽、pVEC、Transportan、Amphiphilic modelpeptide和Arg9等。

运用本发明的培养方法，可以通过二维或三维培养体系培养和诱导，使得非神经元细胞转分化为去甲肾上腺素能神经元。

本发明的方法所获得的去甲肾上腺素能神经元可冻存、复苏、传代、长时间维持培养。此外，还应理解，本发明的方法中的起始细胞，可以为生物体分离的原代细胞，或者可以为建系的细胞。

培养的去甲肾上腺素能神经元及组合物

基于本发明的新发现，提供了一种由本发明所述的方法获得的去甲肾上腺素能神经元培养物或从该去甲肾上腺素能神经元培养物中分离纯化的去甲肾上腺素能神经元。

从细胞培养物中富集或分离纯化细胞的方法也是本领域人员熟知的，例如可基于去甲肾上腺素能神经元的特定形态特征来进行富集；或基于去甲肾上腺素能神经元所表达的特殊蛋白或分子标记来选择收集(例如采用特异性抗体或配体)。

本发明培养的去甲肾上腺素能神经元有着多方面的用途。包括但不限于：用于制备预防、改善或治疗神经系统疾病(包括精神类疾病和神经退行性疾病，如神经损伤、孤独症、抑郁症、精神分裂症、药物成瘾、帕金森氏症、阿尔兹海默症和脊髓损伤等)的药物；用于作为体外模型，进行神经系统疾病及其药物的研究(例如，用于筛选作用于去甲肾上腺素能神经元受体以及转运体的药物小分子)；用于制备体内细胞移植的组合物，用于体内研究(比如通过AAV载体承载的方式注射到脑内)，检测能否在脑内原位诱导胶质细胞产生功能性的NA神经元并用于神经再生以及功能恢复。其中，所述的神经系统疾病及其药物的研究包括但不限于：研究药物运输、药物代谢、神经系统形成；或神经元毒性测试、筛选神经元毒性物质、筛选调节神经元功能的物质。

在需要的情况下，本发明培养的去甲肾上腺素能神经元还可进一步被应用于基因工程重组，形成重组的细胞，例如为了赋予细胞进一步的功能或特征，在细胞中转入外源的基因表达盒，或对细胞的基因组进行基因敲除或基因编辑等。

本发明还提供了一种组合物(药物)，所述组合物含有：有效量的所述的去甲肾上腺素能神经元(如1×10⁴-1×10¹²个；较佳的1×10⁵-1×10¹⁰个)；以及药学上可接受的载体。其含有有效量的所述的去甲肾上腺素能神经元以及药学上可接受的载体。所述的组合物对于动物没有可见的毒性和副作用。

所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

本发明还提供了一种药盒，其中含有本发明培养的去甲肾上腺素能神经元或含有该去甲肾上腺素能神经元的组合物或培养物。较佳地，所述药盒中还包含使用说明书，从而便于本领域人员在研究中或在临床上应用。

在本发明的具体实施例中，通过多方面筛选，找到了重编程产生去甲肾上腺素能神经元的有效转录因子组合。通过多方面鉴定，确认了重编程产生的去甲肾上腺素能神经元是功能性的去甲肾上腺素能神经元。结合细胞生物学、生物化学、电生理等多方面技术手段检测表明：诱导得到的去甲肾上腺素能神经元与体内内源的去甲肾上腺素能神经元比较接近。进而，通过移植实验，探究了重编程产生的去甲肾上腺素能神经元用于神经再生以及修复的可能性。将诱导得到的去甲肾上腺素能神经元移植到新生小鼠侧脑室发现可以存活。

现有的技术产生去甲肾上腺素能神经元主要是通过多潜能的干细胞诱导，干细胞诱导周期长(一个月甚至更长)，诱导条件相对复杂并且可能会更多地涉及到伦理问题，尤其是使用人的胚胎干细胞进行诱导。而本发明采用直接重编程的方式，具有周期短(三周就能诱导得到功能成熟的NA神经元)、操作简单(将本发明筛选得到的转录因子包装成为病毒进行一次性感染即可得到NA神经元)、效率稳定(只要保证病毒滴度以及纯度，可以稳定诱导得到功能性的NA神经元)等优势。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、慢病毒载体的构建以及慢病毒包装

慢病毒载体的构建以及慢病毒包装的操作流程的示意图如图1所示。将候选转录因子的cDNA克隆到慢病毒载体FUGW(能够表达绿色荧光蛋白的载体)，测序确认克隆的cDNA正确无误。将得到的携带转录因子的病毒载体转化大肠杆菌进行大量扩增并与另外两个病毒包装辅助质粒pCMV-dR8.91(Delta 8.9)和pCMV-VSV-G共转染293T细胞进行病毒包装。用超速离心的方式浓缩慢病毒上清，并将得到的病毒沉淀溶解后分装置于-80℃备用。

实施例2、原代细胞的制备及纯度鉴定

将实验小鼠埋入碎冰中5min左右使其冻晕，75％酒精快速全身浸泡消毒实验小鼠。剪去小鼠头部并立刻转移到含冰冷解剖液的10cm培养皿中，剪去头部皮肤。将分离的头部置于解剖镜下去掉颅骨，剖出全脑，转移到新的含解剖液的10cm培养皿中。在解剖镜下去掉小脑、大脑，保留中脑，沿延髓孔往两侧截断即可分离出背侧中脑组织。用尖头镊子小心去除脑膜后将中脑背部顶盖组织置于新的3.5cm培养皿中，用解剖液依次洗三遍，最后将组织转移到干净的3.5cm培养皿中。用微量移液器吸掉多余的缓冲液，随后用维纳斯剪将脑组织剪碎成约1mm³小块。加入6ml消化液(平均每只中脑用量1ml)，并将脑组织转移到15ml离心管中，37℃消化15min。在此期间每5min颠倒混匀离心管一次。加入6ml终止液(与消化液等量即可)终止消化，吹打组织块(为防止粘稠，可用DNase I，终浓度为5U/ml)20次左右，将释放出来的细胞通过40μm细胞筛以去除未完全消化的大的组织团块。将得到的细胞悬液1100rpm离心5min，弃去上清，加入37℃预热的胶质培养液10ml重悬细胞然后加入10cm培养皿中，37℃5％CO₂培养20min(此步骤是利用成纤维细胞与胶质细胞具有差速贴壁的特点进一步纯化胶质细胞)。差速贴壁结束后，吸取10cm培养皿中的细胞上清(弃去已经贴壁的细胞)，种入两个25mm培养瓶中，晃匀细胞，37℃5％CO2培养，3天后换液。取材第二天全换液，以后每隔三天换液。培养7-9天发现细胞长满即可置于37℃摇床中(用保鲜袋包裹3层以防止污染)220rpm摇晃20h左右以去除少突胶质细胞。摇完后的细胞用预热的DMEM(含1％PS)洗三次以上，PBS洗一遍后，胰蛋白酶消化传代到2-3个10cm培养皿。继续培养三天左右即可用于诱导或者冻存。

分离的小鼠星形胶质细胞通过免疫组化进行纯度鉴定，大部分的细胞都能够表达星形胶质细胞的标志分子GFAP，如图2所示。

实施例3、病毒感染原代细胞进行诱导以及因子筛选

本发明人在实验初期考虑了较多的因子，对它们进行前期筛选。

诱导前一天用poly-D-lysine(10μg/ml)37℃过夜包被细胞培养玻璃圆片，玻璃圆片放在24孔板中。诱导当天用超纯水洗包被过的玻璃片三次并置于超净台中吹干后再包被laminin(10μg/ml)，37℃2-4h。随后将培养好的胶质细胞或者成纤维细胞种入24孔板的玻璃片上，密度为每孔0.75×10⁵细胞。细胞铺板2h后即可进行病毒感染，提前计算好病毒用量(每种病毒的感染倍数大约为细胞量的10倍，根据细胞密度以及病毒滴度即可算出)。感染12-16h后全换液成诱导培液(DMEM/F-12、2％B-27、1％PS、10μm FSK)，48h后再次全换液成诱导培液。以后每隔3天进行半量换液，半换液的培液为：DMEM/F-12、2％B-27、1％PS、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、10μm FSK。诱导2-3周后用54mM高钾脑脊液刺激不同转录因子组合诱导的细胞，并将收集得到的上清用高氯酸处理后进行高效液相上样。根据高效液相的结果，分析不同转录因子组合诱导得到的细胞释放去甲肾上腺素的水平的高低并以此作为转录因子组合筛选的重要指标。操作流程的示意图如图3A。

实验前期，经过反复实验比较，确定8种因子(F8)作为进一步研究的基础，它们是：Ascl1、Tlx3(T3)、Phox2b(2B)、Phox2a(2A)、AP-2α、Gata3(G3)、Hand2(H2)以及Nurr1(Nr1)。其中，Tlx3的GenBank登录号为NM_019916.2。

分析结果表明，8个候选的转录因子库中，除了转录因子T3以外，其他几个转录因子对于诱导去甲肾上腺素的释放都很重要，如图3B所示。

本发明人还验证了进一步减少部分转录因子后的诱导效果。结果发现，仅仅用Ascl1、Phox2b(2B)、Gata3(G3)三个因子(简称为F3组合)，其效果与空白对照组(FUGW)相比没有明显差异，即无法诱导去甲肾上腺素能神经元的产生，如图3C所示。

此外，本发明人还验证了其他减少部分转录因子后的组合的诱导效果。结果发现仅仅用Ascl1、Phox2b(2B)、Phox2a(2A)、AP-2α、Tlx3(T3)五个因子(简称为F5组合)与空白对照组(FUGW)相比几乎无法诱导去甲肾上腺素能神经元的产生，如图3D所示。

在F5组合的基础上加上Gata3能够产生少量的去甲肾上腺素能神经元，但是诱导效率显著低于F8组合(F5组合加上Gata3(G3)、Hand2(H2)以及Nurr1)，如图3D所示。

在F5组合的基础上加上Hand2其诱导效率也是显著低于F8组合，如图3D所示。在F5组合的基础上同时加上Gata3与Hand2能够产生一些去甲肾上腺素能神经元，但是诱导效率仍旧显著低于F8组合，如图3D所示。

实施例4、免疫细胞化学染色以及实时荧光定量PCR鉴定诱导的细胞

筛选得到的因子组合(Ascl1、Phox2b、Phox2a、AP-2α、Gata3、Hand2、Nurr1)诱导(诱导方法同实施例3中)Dbh-2A-mCherry小鼠(利用CRISPR/Cas9结合同源重组技术，将p2A-mCherry与Dbh基因编码最后一个氨基酸的核苷酸序列融合，得到在基因Dbh位点同源重组敲入2A-mCherry的小鼠Dbh-2A-mCherry)的星形胶质细胞2-3周后通过免疫细胞化学染色对诱导细胞进行检测，具体方法为：4％多聚甲醛室温固定细胞15min，0.2％Triton X-100打孔10min。1×PBS洗2次，每次5min。4％BSA室温封闭1h，然后加入相应的一抗过夜(12～16h)。第二天1×PBS洗3次，每次10min，然后加入相应的二抗，室温1h。1×PBS洗3次每次10min，加入细胞核染料DAPI室温2min，洗去DAPI后与荧光显微镜下初步观察荧光即可封片进行图像采集。免疫组化的结果显示，诱导的细胞表达NA神经元的标志分子多巴胺β-羟化酶(DBH)(染色图中mCherry用于指示DBH的表达)以及酪氨酸羟化酶(TH)，诱导效率约为9％，如图4A。

另外，抽提诱导细胞的RNA并反转成为cDNA，然后进行荧光定量PCR。实验发现，诱导的细胞除了表达Dbh，Th以外，还表达NA神经元其他标志分子的mRNA，比如Ddc，Vmat2，Slc6a2，Galanin，Npy，Htr3a以及Ret基因的mRNA。与对照组感染FUGW相比，感染转录因子诱导得到的NA神经元中这些标志分子都有明显上调，并且与小鼠内源的NA神经元接近，如图4B。

实施例5、单细胞膜片钳记录诱导的细胞

利用筛选得到的因子组合(Ascl1、Phox2b、Phox2a、AP-2α、Gata3、Hand2、Nurr1)诱导(诱导方法同实施例3中)Dbh-2A-mCherry小鼠的星形胶质细胞，在诱导3～4周的时候，用单细胞膜片钳技术对诱导的mCherry表达阳性的细胞进行记录。

记录的结果表明，诱导的NA神经元可以产生钠电流(图5A)，并且在去极化电流的作用下能够爆发动作电位(图5B)；除此之外，诱导的NA神经元还能够产生自发的兴奋性突触后电流(图5C)。

这些结果说明，诱导得到的NA神经元具备神经元的基本电生理特征，并且能够接受其他细胞的输入。

实施例6、诱导的NA神经元与心肌共培养

将从Dbh-2A-mCherry小鼠的星形胶质细胞诱导得到的NA神经元(iNAs)与新生小鼠心室肌细胞(MVM)进行共培养，通过免疫电镜的方法观察发现，诱导的NA神经元可以与心室肌细胞形成突触连接，如图6所示。红色箭头指示的黑色颗粒为利用anti-DsRed抗体得到的增强的免疫胶体金颗粒，其代表的是诱导的NA神经元表达的标志分子DBH。心肌细胞中可以观察到明显的排列整齐的心肌纤维、Z带(黑色箭头指示)以及较多的线粒体(M)(图6左)。图6右半部分为左边黄色方框的放大，可以看到诱导的NA神经元末梢内含有囊泡(V，白色箭头指示)，并且诱导的NA神经元与心室肌细胞(MVM)形成了类似突触致密带的结构(白色小三角指示)。

实施例7、用转录因子Gata3的类似物Gata2替代Gata3后进行诱导可以得到类似于Gata3的效果

本发明人还验证了转录因子同家族的类似物在诱导NA神经元中的作用，如图7所示，与对照组FUGW相比，F5组合(Ascl1、Phox2b、Phox2a、AP-2α、Tlx3)加上Gata3(G3)可以诱导Dbh-2A-mCherry小鼠的星形胶质细胞产生mCherry(代表NA神经元的标志分子DBH)以及TH表达阳性的去甲肾上腺素能神经元。

F5组合加上Gata2(G2)也能诱导星形胶质细胞产生mCherry(代表NA神经元的标志分子DBH)以及TH表达阳性的去甲肾上腺素能神经元，如图7所示。这一实例说明，Gata2能够替代Gata3与其他转录因子一起诱导去甲肾上腺素能神经元的产生。

实施例8、用转录因子AP-2α的类似物AP-2β替代AP-2α后进行诱导可以得到类似于AP-2α的效果

本发明人还验证了转录因子AP-2α的同家族类似物AP-2β在诱导NA神经元中的作用。如图8A所示，包含AP-2α的较佳的七因子组合(Ascl1、Phox2b、Phox2a、AP-2α、Gata3、Hand2、Nurr1)能够诱导Dbh-2A-mCherry小鼠的星形胶质细胞产生大量的mCherry以及TH表达阳性的去甲肾上腺素能神经元。

用AP-2β替代七因子组合中的AP-2α后进行同样的诱导，结果表明包含AP-2β的七因子组合也能诱导星形胶质细胞产生大量的mCherry以及TH表达阳性的去甲肾上腺素能神经元。F7(AP-2α)组合以及F7(AP-2β)组合诱导星形胶质细胞产生去甲肾上腺素能神经元的效率没有明显的差异，如图8B统计图所示。

这一实例说明，AP-2β能够替代AP-2α与其他转录因子一起诱导去甲肾上腺素能神经元的产生。

实施例9、小鼠胚胎成纤维细胞被诱导产生功能性的去甲肾上腺素能神经元

本发明人还用Dbh-2A-mCherry小鼠胚胎14.5天的成纤维细胞作为起始细胞进行了诱导，如图9A所示。所使用的的转录因子组合为Ascl1、Phox2b、Phox2a、AP-2α、Gata3、Hand2、Nurr1，即F7组合。

诱导结果如图9B所示，与对照组FUGW相比，F7组合可以诱导成纤维细胞高效产生mCherry以及TH阳性的去甲肾上腺素能神经元，诱导效率大约为42％。这些诱导的去甲肾上腺素能神经元还表达成熟神经元以及去甲肾上腺素能神经元其他的标志分子，比如Synapsin I，DDC，VMAT2，NET，Galanin，NPY，如图9C所示。并且成纤维细胞产生的去甲肾上腺素能神经元能够释放去甲肾上腺素，如图9D所示。与此同时，成纤维细胞产生的去甲肾上腺素能神经元具备成熟神经元的基本电生理特征，包括：在给予去极化电压的情况下，能够产生钠电流(图9E以及9F)，并且在去极化电流的作用下能够爆发动作电位(图9G)；除此之外，成纤维细胞诱导产生的去甲肾上腺素能神经元还能够产生后超极化电位(图9H)以及自发的兴奋性的突触后电流(图9I)。

这一实例说明，本发明筛选出来的转录因子组合能够将小鼠胚胎成纤维细胞诱导成为功能性的去甲肾上腺素能神经元。

实施例10、诱导的NA神经元的移植

如图10A，用Accutase消化F7组合诱导Dbh-2A-mCherry小鼠星形胶质细胞2周后的神经元样细胞，离心去除上清使得细胞浓缩后密度大约为2×10⁵cells/μl，每只小鼠移植2μl即总共4×10⁵细胞。移植的部位为新生小鼠侧脑室。

免疫组化的结果表明，诱导的mCherry阳性的NA神经元可以在新生小鼠脑室附近(图10B)以及小鼠皮层边缘(图10C)存活，并表达成熟神经元的标志分子NeuN(图10D)以及NA神经元的标志分子TH(图10E)。

更进一步的脑片电生理记录的实验结果表明，记录到的mCherry阳性的诱导的NA神经元(图10F)能够在给予去极化电压的情况下，产生钠电流(图10G)，并且在去极化电流的作用下能够爆发动作电位(图10H)。

除此之外，移植的诱导的去甲肾上腺素能神经元还能够产生自发的兴奋性的突触后电位(图10I)。

上述研究说明，本发明产生的去甲肾上腺素能神经元能够在移植到新生小鼠脑室的情况下存活并具备基本的电生理功能。

实施例11、人源细胞能够被诱导为功能性的去甲肾上腺素能神经元

本发明人还使用人源的细胞进行了试验。在本实施例中，人源的细胞为亚洲男性儿童的包皮成纤维细胞。所使用的转录因子组合为F7组合另外加上具有抗凋亡作用的因子Bcl2l1。

如图11A所示，该转录因子组合可以诱导人包皮成纤维细胞表达去甲肾上腺素能神经元的标志分子TH以及DBH，诱导效率大约为14％(图11B)。

除此之外，人包皮成纤维细胞诱导的神经元还表达成熟神经元的标志分子SYN1以及单胺类囊泡转运体VMAT2(图11C)。

荧光定量PCR的结果表明，与对照组病毒诱导的细胞相比，F7组合诱导的神经元不仅表达TH、DBH、VMAT2，还表达DDC、NET、MAP2、NPY、GAL、RET(图11D)。

高效液相检测结果表明，人包皮成纤维细胞诱导的神经元在高钾刺激的条件下能够释放去甲肾上腺素(图11E)。并且电生理实验结果表明诱导的DBH阳性的细胞(图11F)能够产生钠电流(图11G)、动作电位(图11H)以及自发的兴奋性的突触后电流(图11I)。

上述研究说明，人源的细胞也能够被本发明筛选的较优的转录因子组合诱导产生功能性的去甲肾上腺素能神经元。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。