FR3048000A1 - METHOD FOR IDENTIFYING ENDOCRINE DISRUPTORS - Google Patents

METHODE POUR IDENTIFIER DES PERTURBATEURS ENDOCRINIENS DOMAINE DE L'INVENTIONMETHOD FOR IDENTIFYING ENDOCRINE DISRUPTORS FIELD OF THE INVENTION

La présente invention concerne une méthode pour identifier des perturbateurs endocriniens, laquelle méthode utilise une lignée cellulaire transformée par une cassette d'expression spécifique.The present invention relates to a method for identifying endocrine disruptors, which method uses a cell line transformed by a specific expression cassette.

ART ANTERIEURPRIOR ART

Le système endocrinien, par le biais de la sécrétion d'hormones essentielles au métabolisme, à la croissance, au développement, au sommeil et à l'humeur, est l'un des systèmes de régulation clé qui contribue au maintien de l'homéostasie chez un individu. Au sein de ce système, la sécrétion d'hormones est assurée par un ensemble de glandes endocrines et exocrines qui sont disséminées dans l'organisme.The endocrine system, through the secretion of hormones essential for metabolism, growth, development, sleep and mood, is one of the key regulatory systems that contributes to the maintenance of homeostasis in an individual. Within this system, the secretion of hormones is ensured by a set of endocrine and exocrine glands that are disseminated in the body.

Maintenant, un certain nombre de substances chimiques d'origine naturelle (hormones et phytoestrogènes) ou artificielle (produits issus de l'industrie chimique contenus dans des objets de consommation courante, produits de traitement des cultures, médicaments, cosmétiques, etc ...), et présentes dans l'environnement, ont été identifiées comme interférant avec le bon fonctionnement du système endocrinien. Ces substances, qualifiées de « perturbateurs endocriniens », induisent alors des effets néfastes sur l'organisme d'un individu et/ou sur ses descendants. Les mécanismes d'action associés à ces perturbations reposent le plus souvent sur la capacité de ces substances à imiter l'action d'une hormone naturelle, à se fixer sur les récepteurs de ces hormones naturelles, et/ou encore à gêner ou à bloquer le mécanisme de production ou de régulation des hormones ou des récepteurs ; ces actions modifiant ainsi les concentrations d'hormones présentes dans l'organisme. Des études réalisées chez l'animal ont notamment contribué à mettre en évidence l'existence d'interactions entre ces composés et des récepteurs hormonaux et à mieux comprendre certains de leurs mécanismes d'action.Now a number of natural chemical substances (hormones and phytoestrogens) or artificial (products from the chemical industry contained in everyday consumer goods, crop treatment products, drugs, cosmetics, etc ...) , and present in the environment, have been identified as interfering with the proper functioning of the endocrine system. These substances, qualified as "endocrine disruptors", then induce adverse effects on the body of an individual and / or his descendants. The mechanisms of action associated with these disturbances are most often based on the ability of these substances to mimic the action of a natural hormone, to bind to the receptors of these natural hormones, and / or to disturb or block the mechanism of production or regulation of hormones or receptors; these actions modify the concentrations of hormones present in the body. Studies in animals have helped to highlight the existence of interactions between these compounds and hormonal receptors and to better understand some of their mechanisms of action.

Agissant à faible dose pour certains d'entre eux, les perturbateurs endocriniens sont aujourd'hui suspectés d'être responsables chez l'Homme de dysfonctionnements de la fonction de reproduction, notamment par le biais de la baisse de la qualité du sperme et de l'augmentation de la fréquence d'anomalies survenant lors du développement du tractus génital dont une augmentation a été observée ces dernières années. A noter en outre que leur implication dans l'étiologie de cancers hormono-dépendants (sein, utérus, prostate, testicules) et de maladies neurodégénérarives (Alzheimer, Parkinson, autisme) a également été rapportée.Acting at a low dose for some of them, endocrine disruptors are now suspected to be responsible in humans for dysfunctions of the reproductive function, notably through the drop in the quality of sperm and the loss of sperm. increase in the frequency of abnormalities occurring during the development of the genital tract, an increase of which has been observed in recent years. Note also that their involvement in the etiology of hormone-dependent cancers (breast, uterus, prostate, testicles) and neurodegenerative diseases (Alzheimer's, Parkinson's, autism) has also been reported.

Aussi, il est particulièrement critique aujourd'hui de pouvoir identifier de tels perturbateurs pour en empêcher, ou à minima en encadrer, la commercialisation.Also, it is particularly critical today to be able to identify such disrupters to prevent, or at least to control, marketing.

Maintenant, l'identification de tels perturbateurs endocriniens est rendue particulièrement délicate, dans la mesure où ces substances sont susceptibles d'agir à très faible dose, qui plus est souvent selon un effet cumulatif et/ou synergique. De plus, la sensibilité d'un organisme aux perturbateurs endocriniens peut également varier selon les périodes de la vie, ce qui complique encore leur identification rigoureuse.Now, the identification of such endocrine disruptors is made particularly difficult, insofar as these substances are likely to act at very low dose, which is often in a cumulative and / or synergistic effect. In addition, the sensitivity of an organism to endocrine disruptors may also vary according to the periods of life, which further complicates their rigorous identification.

Bien qu'un certain nombre de ces perturbateurs endocriniens aient déjà été identifiés et fassent l'objet d'une surveillance accrue (Directives 2000/60/CE et 2013/39/UE), la toxicologie classique réalisée sur les animaux se heurte aux spécificités de ces composés (action à faible dose, effet cumulatif, effet trans-générationnel,...). Par ailleurs, l'apparition chaque année sur le marché mondial de 700 nouveaux composés chimiques rend impossible leur criblage à grande échelle. Récemment, des modèles cellulaires ont été mis au point dans le but de cribler des composés interférant avec le développement du système nerveux. Il s'agit soit de lignées immortalisées, de cultures primaires, de cellules souches pluripotentes ou encore de progéniteurs neuronaux multipotents (BREIER et al., Neurotoxicology and teratology 2010, vol. 32, pp4-15). Toutefois, la mise en culture de lignées cellulaires ou de cultures primaires conduit rapidement à la perte du phénotype de cellules neuronales différenciées, rendant incertain l'extrapolation des résultats obtenus sur de tels modèles avec Vin vivo. S'agissant des cellules souches pluripotentes, leur approvisionnement pose un problème éthique, en particulier chez l'homme. L'unique modèle commercial de progéniteur neuronal actuellement disponible sont les lignées ReNcell™ VM et ReNcell™ CX dérivées de la région mésencéphalique d'un cerveau humain en développement (BREIER et al., Toxicological Sciences 2008, vol.105, n°l, ppll9-138/ DONATO étal., BMC Neuroscience 2007, vol.8, n°36, ppl-11).Although a number of these endocrine disruptors have already been identified and are subject to increased surveillance (Directives 2000/60 / EC and 2013/39 / EU), classical animal toxicology faces specificities. of these compounds (low-dose action, cumulative effect, trans-generational effect, etc.). Moreover, the appearance on the world market of 700 new chemical compounds each year makes it impossible to screen them on a large scale. Recently, cellular models have been developed for the purpose of screening for compounds interfering with the development of the nervous system. They are either immortalized lines, primary cultures, pluripotent stem cells or multipotent neuronal progenitors (BREIER et al., Neurotoxicology and Teratology 2010, vol 32, pp4-15). However, the culturing of cell lines or primary cultures rapidly leads to the loss of the phenotype of differentiated neuronal cells, making it doubtful to extrapolate the results obtained on such models with Vin vivo. With regard to pluripotent stem cells, their supply poses an ethical problem, particularly in humans. The only commercial model of neuronal progenitor currently available are the ReNcell ™ VM and ReNcell ™ CX lines derived from the mesencephalic region of a developing human brain (BREIER et al., Toxicological Sciences 2008, vol.105, no. ppll9-138 / DONATO et al., BMC Neuroscience 2007, vol.8, no. 36, ppl-11).

Il existe par conséquent un réel besoin de développer de nouveaux outils permettant le criblage, in vitro et à grande échelle, des composés dont on soupçonne qu'ils possèdent un effet de perturbateur endocrinien et, plus particulièrement, de ceux liés à la perturbation de la fonction de reproduction.There is, therefore, a real need to develop new tools for screening, in vitro and on a large scale, compounds suspected of endocrine disruptors and, more particularly, those related to the disturbance of reproduction function.

RESUME DE L'INVENTIONSUMMARY OF THE INVENTION

Les inventeurs ont maintenant mis au point un nouveau procédé qui, malgré son apparente simplicité, permet tout à la fois d'opérer un criblage de potentiels perturbateurs endocriniens in vitro et à grande échelle, le tout en faisant fi des problèmes de stabilité sur le long terme du phénotype nerveux des modèles cellulaires.The inventors have now developed a new method which, in spite of its apparent simplicity, makes it possible at the same time to screen endocrine disrupters in vitro and on a large scale, while ignoring stability problems along the way. term of the nervous phenotype of cellular models.

Pour se faire, l'invention a pour objet une cassette d'expression comprenant une séquence d'acide nucléique codant pour un oncogène liée de manière opérationnelle à un promoteur inductible, ledit promoteur inductible comprenant (i) une région promotrice minimale et (ii) au moins une séquence régulatrice GBS (Gli-binding site), et, optionnellement, une séquence régulatrice 5' UTR placée en amont de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène et/ ou une séquence régulatrice 3' UTR placée à l'extrémité 3' de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène.To do this, the subject of the invention is an expression cassette comprising a nucleic acid sequence encoding an oncogene operably linked to an inducible promoter, said inducible promoter comprising (i) a minimal promoter region and (ii) at least one GBS (Gli-binding site) regulatory sequence, and, optionally, a 5 'UTR regulatory sequence placed upstream of the nucleic acid sequence coding for the oncogene and / or a 3' UTR regulatory sequence placed at the 3 'end of the nucleic acid sequence encoding the oncogene.

De la sorte, la cassette d'expression selon l'invention présente un profil d'expression correspondant à celui du gène Sox2, lequel gène est caractéristique des cellules pluripotentes. Cette cassette d'expression permet le maintien en culture des cellules transformées par celle-ci tant qu'elles se trouvent sous une forme indifférenciée. En fonction des besoins en termes de criblage, il est alors possible d'induire la différenciation de ces cellules transformées en cellules nerveuses et, alors, de tester sur ces dernières l'action d'éventuels perturbateurs endocriniens.In this way, the expression cassette according to the invention has an expression profile corresponding to that of the Sox2 gene, which gene is characteristic of pluripotent cells. This expression cassette makes it possible to keep the cells transformed by it in culture while they are in an undifferentiated form. Depending on the needs in terms of screening, it is then possible to induce the differentiation of these transformed cells into nerve cells and then to test on them the action of potential endocrine disruptors.

De préférence, l'oncogène est spécifique des progéniteurs neuronaux. De la sorte, l'oncogène utilisé permet l'amplification cellulaire et, simultanément, l'activation des gènes de multipotence de ces cellules. Ainsi, le système d'amplification des progéniteurs neuronaux en culture limite, autant que faire se peut, la perturbation du profil d'expression spécifique de ces progéniteurs, et contribue donc à maintenir la nature même de ces progéniteurs et des cellules qui pourraient en être issues. Cet élément est d'autant plus important que ce système a vocation à être un modèle de ces cellules in vivo. L'invention a également pour objet un vecteur d'expression comprenant la cassette d'expression selon l'invention, une cellule hôte comprenant une cassette ou un vecteur selon l'invention. L'invention est également relative à une cassette d'expression, un vecteur ou une cellule hôte pour leur utilisation dans le criblage de composés perturbateurs endocriniens. L'invention se rapporte encore à un procédé d'amplification cellulaire comprenant l'étape de : a) Mise en culture de progéniteurs neuronaux, transformés par une cassette d'expression selon l'invention, dans un milieu de culture approprié.Preferably, the oncogene is specific for neuronal progenitors. In this way, the oncogene used allows cell amplification and, simultaneously, the activation of the multipotency genes of these cells. Thus, the amplification system of neuronal progenitors in culture limits, as far as possible, the disturbance of the specific expression profile of these progenitors, and thus contributes to maintaining the very nature of these progenitors and the cells that could be issues. This element is all the more important as this system is intended to be a model of these cells in vivo. The subject of the invention is also an expression vector comprising the expression cassette according to the invention, a host cell comprising a cassette or a vector according to the invention. The invention also relates to an expression cassette, a vector or a host cell for their use in the screening of endocrine disrupting compounds. The invention also relates to a cell amplification process comprising the step of: a) culturing neuronal progenitors, transformed by an expression cassette according to the invention, in a suitable culture medium.

Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend, préalablement à l'étape a), une étape de transformation de ces progéniteurs neuronaux par une telle cassette d'expression selon l'invention, ou par un vecteur la comprenant.According to a preferred embodiment, the method according to the invention is characterized in that it comprises, prior to step a), a step of transformation of these neuronal progenitors with such an expression cassette according to the invention, or by a vector comprising it.

Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il vise, en outre, à l'obtention de cellules nerveuses différenciées et en ce qu'il comprend une étape supplémentaire b) de différenciation des progéniteurs neuronaux en neurones et/ou en cellules gliales choisies parmi les astrocytes et les oligodendrocytes, laquelle différenciation est induite par une modification de la composition du milieu de culture utilisé à l'étape a).According to another preferred embodiment, the method according to the invention is characterized in that it also aims at obtaining differentiated nerve cells and in that it comprises an additional step b) differentiation of the progenitors neurons and / or glial cells selected from astrocytes and oligodendrocytes, which differentiation is induced by a change in the composition of the culture medium used in step a).

Selon encore un autre mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention est caractérisé en ce qu'il vise le criblage d'un composé perturbateur endocrinien et en ce qu'il comprend en outre les étapes de : c) Mise en contact des cellules obtenues à l'issue de l'étape b) du procédé avec au moins un composé, d) détermination de tout changement métabolique et/ou phénotypique des cellules résultant de la mise en contact avec ledit au moins un composé lors de l'étape c), et e) Identification, en tant que composé perturbateur endocrinien, de tout composé ayant entraîné un changement métabolique et/ou phénotypique à l'issue de l'étape d).According to yet another preferred embodiment, the method of the invention is characterized in that it relates to the screening of an endocrine disrupting compound and in that it further comprises the steps of: c) bringing the cells obtained at the end of step b) of the method with at least one compound, d) determination of any metabolic and / or phenotypic change of the cells resulting from the bringing into contact with the said at least one compound during step c), and e) Identification, as an endocrine disrupting compound, of any compound having caused a metabolic and / or phenotypic change at the end of step d).

Un autre aspect de l'invention concerne enfin un kit pour le criblage de composés perturbateurs endocriniens comprenant une cassette d'expression selon l'invention.Another aspect of the invention finally relates to a kit for the screening of endocrine disrupting compounds comprising an expression cassette according to the invention.

DESCRIPTION DES DESSINSDESCRIPTION OF THE DRAWINGS

La figure 1 est une représentation schématique du plasmide Sox2p-Myc.Figure 1 is a schematic representation of the Sox2p-Myc plasmid.

La figure 2 est une représentation schématique du plasmide lentiviral d'expression pLV.EFl.MCSFigure 2 is a schematic representation of the lentiviral expression plasmid pLV.EF1.MCS

La figure 3 est une représentation schématique du plasmide lentiviral d'expression pLV.Sox2prom.N-Myc-3'UTRSOX2.Figure 3 is a schematic representation of the lentiviral expression plasmid pLV.Sox2prom.N-Myc-3'UTRSOX2.

La figure 4 illustre l'engagement des cellules de la placode oflactive dans le lignage neuronal (antigène Tuj-1) ou glial (antigène GFAP) après leur transduction avec le transgène pSOX2-Nmyc. La détection est réalisée par immunodétection à l'aide d'anticorps spécifiques.Figure 4 illustrates the commitment of oflactive placode cells in the neuronal (Tuj-1 antigen) or glial (GFAP antigen) lineage after transduction with the pSOX2-Nmyc transgene. The detection is carried out by immunodetection using specific antibodies.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTIONDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Un premier objet de l'invention concerne un procédé d'amplification cellulaire comprenant les étapes de : a) Mise en culture de progéniteurs neuronaux transformés par une cassette d'expression comprenant : - une séquence d'acide nucléique codant pour un oncogène liée de manière opérationnelle à un promoteur inductible, ledit promoteur inductible comprenant : (i) une région promotrice minimale, et (ii) au moins une séquence régulatrice GBS (Gli-binding site), - et, optionnellement, une séquence régulatrice 5' UTR placée en amont de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène et/ ou une séquence régulatrice 3' UTR placée à l'extrémité 3' de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène, dans un milieu de culture approprié.A first subject of the invention relates to a cell amplification method comprising the steps of: a) culturing neuronal progenitors transformed by an expression cassette comprising: a nucleic acid sequence encoding an oncogene linked in a manner operable to an inducible promoter, said inducible promoter comprising: (i) a minimal promoter region, and (ii) at least one GBS (Gli-binding site) regulatory sequence, and, optionally, a 5 'UTR regulatory sequence placed upstream of the nucleic acid sequence encoding the oncogene and / or a 3 'UTR regulatory sequence placed at the 3' end of the nucleic acid sequence encoding the oncogene, in a suitable culture medium.

Par « amplification cellulaire », on désigne le processus par lequel une cellule-mère engendre deux cellules-filles identiques entre elles et à la cellule-mère dont elles dérivent. Ce processus est induit par des signaux mitogènes présents dans l'environnement immédiat de la cellule. Des divisions cellulaires successives permettent de produire un grand nombre de cellules.By "cell amplification" is meant the process by which a parent cell generates two daughter cells identical to each other and to the parent cell from which they derive. This process is induced by mitogenic signals present in the immediate environment of the cell. Successive cell divisions make it possible to produce a large number of cells.

Par « progéniteurs neuronaux », on désigne des cellules dérivées de cellules souches pluripotentes capables de renouveler leur population et de s'engager dans le lignage neuronal. Les progéniteurs neuronaux utilisés dans le procédé selon l'invention peuvent provenir de différents tissus embryonnaires de mammifères non humains. Par définition, ces progéniteurs neuronaux ont la capacité de se différencier en neurones et en cellules gliales. L'état de progéniteurs neuronaux peut être évalué par de techniques in vitro bien connues de l'homme de l'art et qui incluent notamment des tests de différenciation in vitro. De telles cellules expriment un certain nombre de marqueurs caractéristiques de leur origine neurale. Il s'agit notamment des gènes Sox2 (sex determining région Y-box 2), GFAP (glial fibrillary acidic protein), et DCX (doublecortin).By "neuronal progenitors" are meant cells derived from pluripotent stem cells capable of renewing their population and engaging in the neuronal lineage. The neuronal progenitors used in the method according to the invention may come from different embryonic tissues of non-human mammals. By definition, these neuronal progenitors have the ability to differentiate into neurons and glial cells. The state of neuronal progenitors can be evaluated by in vitro techniques well known to those skilled in the art and which include in vitro differentiation tests. Such cells express a number of markers characteristic of their neural origin. These include the genes Sox2 (sex determination region Y-box 2), GFAP (glial fibrillary acidic protein), and DCX (doublecortin).

Par « milieu de culture approprié », on entend un milieu de culture permettant d'éviter la différenciation des progéniteurs neuronaux. La supplémentation du milieu de culture par une combinaison des facteurs de croissance EGF (Epidermal Growth Factor) et bFGF (Fibroblast Growth Factor 2) permet le maintient des progéniteurs neuronaux à l'état prolifératif, bloquant ainsi leur différenciation (REYNOLDS et al., Science 1992, vol. 27: ppl707-1710).By "appropriate culture medium" is meant a culture medium to avoid the differentiation of neuronal progenitors. Supplementation of the culture medium by a combination of EGF (Epidermal Growth Factor) and bFGF (Fibroblast Growth Factor 2) growth factors allows the maintenance of neuronal progenitors in the proliferative state, thus blocking their differentiation (REYNOLDS et al., Science 1992, vol 27: ppl707-1710).

Cet environnement s'étend non seulement au milieu de culture en tant que tel mais également aux matrices recouvrant le support de culture utilisé. Il est entendu que ni le milieu de culture, ni la matrice ne doivent entraîner les progéniteurs neuronaux dans un processus de différenciation.This environment extends not only to the culture medium as such but also to the matrices covering the culture medium used. It is understood that neither the culture medium nor the matrix should train the neuronal progenitors in a process of differentiation.

De préférence, le milieu de culture doit contenir tous les éléments nutritionnels indispensables à fa multiplication des cellules (acides aminés, bases azotées, minéraux, facteurs de croissances, ions,...).Preferably, the culture medium must contain all the nutritional elements essential for cell multiplication (amino acids, nitrogen bases, minerals, growth factors, ions, etc.).

Dans un mode de réalisation particulier, les facteurs de croissance bFGF (basic fibroblast growth factor) et EGF (epidermal growth factor) sont présents dans le milieu de culture des progéniteurs neuronaux de l'étape a).In a particular embodiment, the growth factors bFGF (basic fibroblast growth factor) and EGF (epidermal growth factor) are present in the culture medium of the neuronal progenitors of step a).

Dans un mode de réalisation particulier, les progéniteurs neuronaux sont maintenus en suspension dans le milieu de culture.In a particular embodiment, the neuronal progenitors are kept in suspension in the culture medium.

La culture des progéniteurs neuronaux peut également être envisagée sur un support de culture pourvu d'une matrice de nature protéique, comprenant un mélange de glycoprotéines de structure (laminine, entactine), de collagènes et de protéoglycannes de type héparane sulfate. Le but de cette matrice est de recréer un environnement proche de celui observé à l'état physiologique. Il existe des préparations commerciales de ce type de matrice qui sont bien connues de l'homme de l'art. Toutefois, l'adhésion des progéniteurs neuronaux sur un tel support de culture ne devra pas entraîner leur différenciation.The culture of neuronal progenitors can also be envisaged on a culture support provided with a matrix of protein nature, comprising a mixture of glycoproteins of structure (laminin, entactin), collagen and proteoglycans of heparan sulfate type. The purpose of this matrix is to recreate an environment close to that observed in the physiological state. There are commercial preparations of this type of matrix which are well known to those skilled in the art. However, the adhesion of neuronal progenitors on such a culture medium should not cause their differentiation.

Dans un mode de réalisation particulier, une matrice synthétique de type Matrigel™ est utilisée pour recouvrir le support de culture des progéniteurs neuronaux.In a particular embodiment, a Matrigel ™ type synthetic matrix is used to cover the culture support of the neuronal progenitors.

De préférence, les cellules souches pluripotentes sont issues de la culture d'explants de placodes olfactives d'embryons de mammifères non humains. Les placodes olfactives sont des épaississements ectodermiques qui participent à la formation des organes des sens et des ganglions sensitifs des nerfs crâniens. Les placodes olfactives sont situées symétriquement de part et d'autre de la ligne médiane, au rebord antério-inférieur, du bourgeon frontal de l'embryon.Preferably, the pluripotent stem cells are derived from the culture of olfactory placode explants from non-human mammalian embryos. The olfactory placodes are ectodermal thickenings which participate in the formation of sensory organs and sensory ganglia of the cranial nerves. The olfactory placodes are located symmetrically on both sides of the median line, at the anterior-inferior border, of the frontal bud of the embryo.

De préférence, les expiants de placodes olfactives sont prélevés sur des embryons de mammifères non humains à un stade de développement précoce qui correspond au début de l'invagination des cavités nasales. Ce stade pourra varier en fonction du mammifère non humain. Ainsi, les expiants de placodes olfactives sont prélevés sur des embryons de souris de 11,5 jours (stade Eli.5 du développement embryonnaire) alors qu'ils seront prélevés plus tardivement notamment chez le rat (stade E15), le mouton (stade E30) ou le singe rhésus (stade E35).Preferably, olfactory placode explants are taken from non-human mammal embryos at an early stage of development that corresponds to the beginning of intussusception of the nasal cavities. This stage may vary depending on the non-human mammal. Thus, olfactory placode explants are taken from 11.5-day-old mouse embryos (Eli.5 stage of embryonic development) whereas they will be taken later, especially in rats (stage E15), sheep (stage E30). ) or the rhesus monkey (stage E35).

La mise en culture des expiants de placodes olfactives est réalisée selon la méthode décrite par CONSTANTIN et al. (Endocrinology 2009, vol.150 n°7:pp3221-3227). Brièvement, les fosses nasales issues d'embryons de mammifères non humains sont prélevées de manière stérile au stade Eli.5 et placées dans un mélange de milieu SFM et de solution tamponnée enrichie en glucose. Puis, les cellules des placodes olfactives sont dissociées de manière mécanique, filtrées, centrifugées et le culot cellulaire est finalement remis en suspension dans du milieu SFM.The culture of olfactory placode explants is carried out according to the method described by CONSTANTIN et al. (Endocrinology 2009, vol.150 No. 7: pp3221-3227). Briefly, the nasal passages from non-human mammalian embryos are removed in a sterile manner at stage El.5 and placed in a mixture of SFM medium and glucose-enriched buffered solution. Then, the cells of the olfactory placodes are dissociated mechanically, filtered, centrifuged and the cell pellet is finally resuspended in SFM medium.

Le milieu SFM est un mélange 50/50 des milieux de culture BME (Basal Medium Eagle) et Ham's F-12, dans lequel sont ajoutés 1% de BSA (bovin sérum albumin), 0,1 mM de putrescine, 5pg/ml d'insuline, 100 pg/ml de transferrine, 3.10'8M de sélénium, 2 mM de glutamine, 5mg/ml de glucose, 38 μΜ de de vitamine C et un cocktail d'antibiotiques pénicilline (50 pg/ml)-streptomycine (50 pg/ml)-néomycine (100 pg/ml). Les concentrations indiquées sont les concentrations finales.SFM medium is a 50/50 mixture of BME (Basal Medium Eagle) and Ham's F-12 culture media, in which 1% BSA (bovine serum albumin), 0.1 mM putrescine, 5 μg / ml d insulin, 100 μg / ml transferrin, 3.10'8 M selenium, 2 mM glutamine, 5 mg / ml glucose, 38 μl vitamin C and a cocktail of antibiotics penicillin (50 μg / ml) -treptomycin (50 μg / ml) pg / ml) -neomycin (100 μg / ml). The concentrations indicated are the final concentrations.

Les conditions de mise en culture d'explants de la placode olfactive permettent l'obtention de cellules caractéristiques de l'ectoderme, et, en particulier, du neuroectoderme. Ces cellules, qualifiées de progéniteurs neuronaux, sont un mélange de neuroblastes et de glioblastes qui leur confère un caractère multipotent, c'est-à-dire qu'elles permettent d'obtenir différents lignages cellulaires. Ainsi, en fonction des conditions de cultures, les progéniteurs neuronaux se différencient respectivement en neurones ou en cellules gliales. Les cellules gliales comportent des astrocytes (cellules protectrices et nourricières des neurones) et des oligodendrocytes qui forment un manchon isolant de myéline autour des axones des neurones. Il est donc possible d'obtenir un mélange de cellules différenciées à partir de progéniteurs neuronaux.The conditions for culturing explants of the olfactory placode make it possible to obtain characteristic cells of the ectoderm, and in particular of the neuroectoderm. These cells, called neuronal progenitors, are a mixture of neuroblasts and glioblasts that gives them a multipotent character, that is to say that they make it possible to obtain different cell lineages. Thus, depending on the culture conditions, the neuronal progenitors are differentiated respectively into neurons or glial cells. Glial cells contain astrocytes (protective and nerve cells of neurons) and oligodendrocytes that form an insulating sleeve of myelin around the axons of neurons. It is therefore possible to obtain a mixture of differentiated cells from neuronal progenitors.

Les cellules pluripotentes issues de la placode olfactive possèdent la capacité de s'engager dans le lignage neurogénique et, ainsi, de se différencier en neurones et/ou en cellules gliales incluant des astrocytes et des oligodendrocytes. Le procédé selon l'invention permet ainsi d'aboutir à des cultures multicellulaires, permettant de réaliser des tests toxicologiques in vitro s'approchant au plus près de la réalité de Vin vivo.Pluripotent cells derived from the olfactory placode possess the ability to engage in the neurogenic lineage and, thus, to differentiate into neurons and / or glial cells including astrocytes and oligodendrocytes. The method according to the invention thus makes it possible to lead to multicellular cultures, making it possible to carry out in vitro toxicological tests approaching closer to the reality of Vin vivo.

Compte tenu de leur origine embryonnaire, les progéniteurs neuronaux sont des cellules qui possèdent un fort taux d'expression du gène Sox2 (pour Sex determining région Y-box 2). Ce facteur de transcription a la capacité de s'autoréguler et, en s'associant avec d'autres facteurs de transcription, de réguler un groupe de gènes conduisant au maintien du caractère multipotent des progéniteurs neuronaux. De la sorte, par le choix d'un promoteur inductible s'approchant de ce gène, on limite autant que possible l'amplification des cellules en culture à celles exprimant ce gène et bénéficiant donc effectivement du caractère multipotent des progéniteurs neuronaux.Given their embryonic origin, neuronal progenitors are cells that have a high level of expression of the Sox2 gene (for sex determination region Y-box 2). This transcription factor has the ability to self-regulate and, by associating with other transcription factors, to regulate a group of genes leading to the maintenance of the multipotent nature of neuronal progenitors. In this way, by the choice of an inducible promoter approaching this gene, the amplification of the cells in culture is limited as much as possible to those expressing this gene and thus effectively benefiting from the multipotent nature of the neuronal progenitors.

Au sens de la présente invention, une cellule est dite « transformée » lorsqu'une séquence d'acide nucléique exogène a été transférée dans cette cellule par toute méthode bien connue de l'homme de l'art, où lorsque qu'une cellule-fille est issue d'une cellule parente ayant hérité de cette séquence d'acide nucléique. Les termes « transformée », « transfectée », « transduite » et « génétiquement modifiée » sont équivalents au sens de la présente invention et peuvent être employés indifféremment.For the purposes of the present invention, a cell is said to be "transformed" when an exogenous nucleic acid sequence has been transferred into this cell by any method well known to those skilled in the art, or where a daughter is from a parent cell that inherited this nucleic acid sequence. The terms "transformed", "transfected", "transduced" and "genetically modified" are equivalent to the meaning of the present invention and may be used interchangeably.

La séquence d'acide nucléique comporte généralement une séquence codante d'un gène d'intérêt dont on cherche à obtenir un fort niveau d'expression dans la cellule transformée. Selon la technique utilisée, la transformation peut conduire à l'intégration de l'acide nucléique exogène dans le génome de la cellule ou bien le maintenir sous forme épisomale en tant qu'entité reproductive autonome dans le cytoplasme de la cellule.The nucleic acid sequence generally comprises a coding sequence of a gene of interest which is sought to obtain a high level of expression in the transformed cell. Depending on the technique used, the transformation may lead to the integration of the exogenous nucleic acid into the genome of the cell or maintain it in episomal form as an autonomous reproductive entity in the cytoplasm of the cell.

De préférence, la technique de transformation utilisée pour le procédé d'amplification cellulaire selon l'invention conduit à l'intégration de l'oncogène dans le génome des progéniteurs neuronaux. Ainsi, l'oncogène sera transmis à toutes les cellules filles issues des progéniteurs neuronaux permettant, de ce fait, l'obtention d'une lignée stable.Preferably, the transformation technique used for the cell amplification method according to the invention leads to the integration of the oncogene into the genome of the neuronal progenitors. Thus, the oncogene will be transmitted to all the daughter cells from the neural progenitors, thus making it possible to obtain a stable line.

Par « oncogène », on désigne un gène capable d'accroître les capacités mitotiques des cellules dans lesquelles il s'exprime et ainsi de stimuler continuellement la division cellulaire. Les oncogènes ont été largement décrits dans la littérature. Dans le cadre de l'invention, l'oncogène peut être choisi parmi les gènes HRAS / KRAS et NRAS, Her2, Hdm2, N-myc, TAL1, Fli-1, MLL, C cycline Dl, RET, PML, Abl ou C-myc.By "oncogene" is meant a gene capable of increasing the mitotic abilities of the cells in which it is expressed and thus of continuously stimulating cell division. Oncogenes have been widely described in the literature. In the context of the invention, the oncogene may be chosen from the HRAS / KRAS and NRAS genes, Her2, Hdm2, N-myc, TAL1, Fli-1, MLL, cyclin D1, RET, PML, Abl or C -myc.

De préférence, l'oncogène est spécifique de la lignée neurale et, en particulier, des progéniteurs neuronaux.Preferably, the oncogene is specific for the neural lineage and, in particular, for neuronal progenitors.

Le terme « acide nucléique codant pour un oncogène » désigne la séquence d'acide nucléique résultant de l'association de l'intégralité des exons, ou phase ouverte de lecture (ORF) qui permet la transcription et la traduction de la protéine oncogène sous sa forme entière.The term "nucleic acid encoding an oncogene" refers to the nucleic acid sequence resulting from the association of all exons, or open reading phase (ORF) which allows the transcription and translation of the oncogenic protein under its control. whole form.

De préférence, l'oncogène est le gène N-myc. Les séquences de N-myc sont bien connues pour différentes espèces animales et sont définies par les séquences SEQ ID NO : 1 (NM_008709.3, Mus musculus), SEQ ID NO : 2 (NM_005378.5, Homo sapiens), SEQ ID NO : 3 (NM_001013096.1, Rattus norvegicus), SEQ ID NO : 4 (NM_212614.1, Danio rerio) et SEQ ID NO : 5 (NM_001031091.2, Gallus gallus).Preferably, the oncogene is the N-myc gene. The N-myc sequences are well known for different animal species and are defined by the sequences SEQ ID NO: 1 (NM-008709.3, Mus musculus), SEQ ID NO: 2 (NM-005378.5, Homo sapiens), SEQ ID NO : (NM_001013096.1, Rattus norvegicus), SEQ ID NO: 4 (NM_212614.1, Danio rerio) and SEQ ID NO: 5 (NM_001031091.2, Gallus gallus).

Dans un mode de réalisation particulier, l'oncogène N-myc est d'origine murine et est codé par la séquence de SEQ ID NO : 1 (NM_008709.3) ou un dérivé de celle-ci.In a particular embodiment, the N-myc oncogene is of murine origin and is encoded by the sequence of SEQ ID NO: 1 (NM-008709.3) or a derivative thereof.

Dans un mode de réalisation plus particulier, l'oncogène N-myc utilisé dans l'invention correspond aux nucléotides 295 à 1683 de la séquence SEQID NO : 1 (NM_008709.3).In a more particular embodiment, the N-myc oncogene used in the invention corresponds to nucleotides 295 to 1683 of the sequence SEQ ID NO: 1 (NM-008709.3).

Selon l'invention, le terme "dérivé de" correspond à une séquence d'acide nucléique ayant au moins 90% d'identité avec une séquence de référence, particulièrement au moins 95% d'identité et préférentiellement au moins 99% d'identité. Le terme « pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique » fait référence au pourcentage de nucléotides identiques entre deux séquences comparées, ledit pourcentage étant obtenu par le meilleur alignement de la séquence entière. Le terme « meilleur alignement » correspond à l'alignement qui permet d'obtenir le pourcentage d'identité le plus élevé. Il peut être obtenu en utilisant différents algorithmes bien connus de l'homme de l'art (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA, GENETICS COMPUTER GROUP, 575 Science Dr., Madison, Wl USA). N-myc permet d'accroître les capacités mitogènes des seuls progéniteurs neuronaux transformés par la cassette telle que précédemment décrite.According to the invention, the term "derivative of" corresponds to a nucleic acid sequence having at least 90% identity with a reference sequence, particularly at least 95% identity and preferably at least 99% identity. . The term "percentage identity between two nucleic acid sequences" refers to the percentage of identical nucleotides between two compared sequences, said percentage being obtained by the best alignment of the entire sequence. The term "best alignment" is the alignment that achieves the highest percentage of identity. It can be obtained using various algorithms well known to those skilled in the art (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA, GENETICS COMPUTER GROUP, 575 Science Dr., Madison, WI USA). N-myc makes it possible to increase the mitogenic capacities of the only neuronal progenitors transformed by the cassette as previously described.

Le terme « promoteur » est bien connu de l'homme de l'art et se réfère à une région de l'ADN située en amont de la région 5' d'un gène sur laquelle se fixe l'ARN polymérase, et permettant ainsi d'initier la transcription.The term "promoter" is well known to those skilled in the art and refers to a region of the DNA located upstream of the 5 'region of a gene to which the RNA polymerase binds, and thus allowing initiate the transcription.

Selon l'invention, le promoteur est lié à l'oncogène de manière opérationnelle. Généralement, l'expression « lié de manière opérationnelle » signifie que la séquence promotrice est positionnée, par rapport à la séquence codante de l'oncogène, de manière à ce que la transcription de ce dernier puisse être initiée. Cela signifie que le promoteur est positionné en amont de cette région codante et à une distance permettant la transcription de cette dernière.According to the invention, the promoter is linked to the oncogene in an operational manner. Generally, the term "operably linked" means that the promoter sequence is positioned, relative to the coding sequence of the oncogene, so that the transcription of the latter can be initiated. This means that the promoter is positioned upstream of this coding region and at a distance allowing transcription of the latter.

Il existe différents types de promoteurs tels que les promoteurs constitutifs ou les promoteurs inductibles. En ce qui concerne les promoteurs inductibles, qui sont ceux qui nous intéressent, il s'agit de promoteurs dont l'activité est contrôlée par des conditions environnementales particulières, notamment par la présence ou l'absence d'un composé particulier. De la sorte, ces promoteurs permettent, outre l'expression du gène placé en aval, le contrôle de cette expression.There are different types of promoters such as constitutive promoters or inducible promoters. With regard to the inducible promoters, which are those which interest us, they are promoters whose activity is controlled by particular environmental conditions, in particular by the presence or the absence of a particular compound. In this way, these promoters allow, in addition to the expression of the gene placed downstream, the control of this expression.

Les promoteurs utilisés dans le cadre de l'invention peuvent être dérivés de gènes natifs, ou composés de différents éléments dérivés de différents promoteurs naturels, ou encore peuvent comprendre des segments d'ADN synthétiques.The promoters used in the context of the invention may be derived from native genes, or composed of different elements derived from different natural promoters, or may comprise synthetic DNA segments.

De préférence, le promoteur utilisé selon l'invention est dérivé de celui du gène Sox2. Les séquences de Sox2 sont bien connues pour différentes espèces animales et sont définies par les séquences SEQ ID NO : 6 (NM_011443.3, Mus musculus), SEQ ID NO : 7 (NM_003106.3, Homo sapiens), SEQ ID NO: 8 (NM_001109181.1, Rattus norvegicus), SEQ ID NO : 9 (NM_213118.1, Danio rerio) et SEQ ID NO : 10 (NM_205188.2, Gallus gallus).Preferably, the promoter used according to the invention is derived from that of the Sox2 gene. The Sox2 sequences are well known for various animal species and are defined by the sequences SEQ ID NO: 6 (NM-011443.3, Mus musculus), SEQ ID NO: 7 (NM-003106.3, Homo sapiens), SEQ ID NO: 8 (NM_001109181.1, Rattus norvegicus), SEQ ID NO: 9 (NM_213118.1, Danio rerio) and SEQ ID NO: 10 (NM_205188.2, Gallus gallus).

Le promoteur dérivé de celui du gène Sox2 utilisé dans l'invention contient les 4 kb en amont du gène murin Sox2 et a pour séquence SEQ ID NO : 11. Cette séquence est contenue dans la séquence NC_000069.6 correspondant à l'ADN génomique du chromosome 3 de la souris.The promoter derived from that of the Sox2 gene used in the invention contains the 4 kb upstream of the murine Sox2 gene and has the sequence SEQ ID NO: 11. This sequence is contained in the sequence NC_000069.6 corresponding to the genomic DNA of the chromosome 3 of the mouse.

Le terme « région promotrice minimale » désigne des sites de fixations spécifiques de facteurs de transcription, un site d'initiation de la transcription ainsi que des sites de fixation du complexe d'initiation de la transcription (TATA-box) fonctionnels dans une cellule ou un organisme hôte.The term "minimal promoter region" refers to specific transcription factor binding sites, a transcription initiation site as well as functional TATA-box binding sites in a cell or a host organism.

De préférence, la région promotrice minimale du gène Sox2 utilisée dans le procédé selon l'invention correspond à la région s'étendant de la position -528 à la position +238 du gène murin Sox2 ou à un dérivé de celle-ci ; laquelle région permet l'expression de l'oncogène placé en aval, dans des cellules de mammifères. A noter que la position +1 correspondant au site d'initiation de la transcription du gène Sox2. Cette région promotrice minimale est définie par la séquence SEQID NO : 12.Preferably, the minimal promoter region of the Sox2 gene used in the method according to the invention corresponds to the region extending from the -528 position to the +238 position of the murine Sox2 gene or a derivative thereof; which region allows the expression of the oncogene placed downstream, in mammalian cells. Note that the position +1 corresponding to the transcription initiation site of the Sox2 gene. This minimal promoter region is defined by the sequence SEQ ID NO: 12.

La présence des séquences de la région promotrice minimale du gène Sox2 et du gène N-myc peut être mise en évidence par PCR en utilisant le couple d'amorces de séquences SEQ ID NO: 13 (GCGGTAACCACTTTCACGAT) et SEQ ID NO: 14 (TCTAGTCGGCATCACGGTTT).The presence of the sequences of the minimal promoter region of the Sox2 gene and of the N-myc gene can be demonstrated by PCR using the pair of primers with sequences SEQ ID NO: 13 (GCGGTAACCACTTTCACGAT) and SEQ ID NO: 14 (TCTAGTCGGCATCACGGTTT ).

Par « séquence régulatrice GBS (pour Gli-Binding Site) », on désigne toute séquence d'acide nucléique cible de la voie de signalisation Hh/Gli2 capable de lier le facteur de transcription Gli2 (pour Glioma-Associated Oncogene 2). Dans cette voie de signalisation, le facteur de transcription Gli2 se lie à des séquences spécifiques GBS pour moduler la transcription de gènes cibles en réponse à l'activation de la voie Hedgehog (fixation de Hh sur le complexe récepteur Ptc/ co-récepteur Ihog, puis translocation de Smo à la membrane plasmique et au cilium primaire où il régule le Processing et l'activation de Gli2) (ROBBINS et al., Sci Signal. 2013; 5(246): re6. doi:10.1126/scisignal.2002906).By "regulatory sequence GBS (Gli-binding site)" means any target nucleic acid sequence of the signaling pathway Hh / Gli2 capable of binding the transcription factor Gli2 (for Glioma-Associated Oncogene 2). In this signaling pathway, the transcription factor Gli2 binds to specific GBS sequences to modulate the transcription of target genes in response to activation of the hedgehog pathway (Hh binding to the Ptc / Ihog co-receptor complex, then translocation of Smo to the plasma membrane and primary cilium where it regulates the processing and activation of Gli2) (ROBBINS et al., Sci Signal 2013; 5 (246): re6. doi: 10.1126 / scisignal.2002906) .

Les séquences régulatrices GBS ont été décrites pour la première fois dans les années 1990 (KINZLER et al., MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Feb. 1990, pp634-642). Depuis lors, des séquences régulatrices GBS ont été identifiées dans les régions promotrices de gènes impliqués notamment dans les processus de prolifération, différenciation cellulaire ou carcinogénèse. Il s'agit notamment des gènes ReglV, (regenerating islet-derived family member 4), Slfn-4 (Schlafen IV), Sox9-crel, Sox2, insulin-like growth factor binding protein 6 (IGFBP6), Bcl-2, cyclin D2, OPN (ostéopontine), et pkbg (plakoglobine).GBS regulatory sequences have been described for the first time in the 1990s (KINZLER et al., MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Feb. 1990, pp634-642). Since then, GBS regulatory sequences have been identified in the promoter regions of genes involved in particular in the proliferation, cell differentiation or carcinogenesis processes. These include the genes ReglV (regenerating islet-derived family member 4), Slfn-4 (Schlafen IV), Sox9-crel, Sox2, insulin-like growth factor binding protein 6 (IGFBP6), Bcl-2, cyclin D2, OPN (osteopontin), and pkbg (plakoglobin).

La région activatrice RI du gène Sox2, située en 5'UTR, contient deux sites de liaisons GBS1 et GBS2 (Gli-binding sites 1 et 2) du facteur de transcription Gli2. Les deux sites GBS1 et GBS2 sont situés respectivement en position -3364/-3357 et -3239/-3230 du gène murin Sox2 et ont pour séquences respectives TGGTGGTC (SEQ ID NO : 15) et GAACCCACTCA (SEQ ID NO : 16) (TAKANAGA et al., Stem Cells 2009, vol.27, ppl65-174).The enhancer region R1 of the Sox2 gene, located at 5'UTR, contains two GBS1 and GBS2 binding sites (Gli-binding sites 1 and 2) of the transcription factor Gli2. The two sites GBS1 and GBS2 are situated in positions -3364 / -3357 and -3239 / -3230, respectively, of the murine Sox2 gene and have respective sequences TGGTGGTC (SEQ ID NO: 15) and GAACCCACTCA (SEQ ID NO: 16) (TAKANAGA). et al., Stem Cells 2009, vol.27, ppl65-174).

Les sites GBS1 et GBS2 occupent respectivement les positions 34646277 à 34646284 et 34646402 à 34646412 de la séquence NC_000069.6.Sites GBS1 and GBS2 respectively occupy positions 34646277 to 34646284 and 34646402 to 34646412 of sequence NC_000069.6.

Plus particulièrement dans le cadre de l'invention, la au moins une séquence régulatrice GBS présente dans la cassette d'expression comprend ou consiste en la séquence GBS1 ou GBS2 du gène Sox2, ou un dérivé de celle-ci.More particularly in the context of the invention, the at least one GBS regulatory sequence present in the expression cassette comprises or consists of the GBS1 or GBS2 sequence of the Sox2 gene, or a derivative thereof.

De préférence, le promoteur inductible de la cassette d'expression de l'invention comprend deux ou plusieurs copies d'une séquence régulatrice GBS1 ou GBS2 du gène Sox2.Preferably, the inducible promoter of the expression cassette of the invention comprises two or more copies of a regulatory sequence GBS1 or GBS2 of the Sox2 gene.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le promoteur inductible de la cassette d'expression selon l'invention comprend au moins une copie de la séquence régulatrice GBS1 et au moins une copie de la séquence régulatrice GBS2 du gène Sox2.In a particularly preferred embodiment, the inducible promoter of the expression cassette according to the invention comprises at least one copy of the regulatory sequence GBS1 and at least one copy of the regulatory sequence GBS2 of the Sox2 gene.

La structure dudit promoteur inductible est alors optimale pour une expression dans les cellules neuronales multipotentes.The structure of said inducible promoter is then optimal for expression in multipotent neuronal cells.

Le promoteur inductible peut comporter, en sus des séquences régulatrices GBS, d'autres séquences régulatrices indépendantes du facteur de transcription Gli. Ces autres séquences régulatrices peuvent être activées par d'autres facteurs de transcription, notamment des facteurs associés à des voies de signalisation distinctes de celles de la voie Hh/Gli2.The inducible promoter may comprise, in addition to GBS regulatory sequences, other regulatory sequences independent of the transcription factor Gli. These other regulatory sequences may be activated by other transcription factors, including factors associated with signaling pathways distinct from those of the Hh / Gli2 pathway.

La présence dans le milieu de culture d'inducteurs peut encore accroître le niveau d'inductibilité du promoteur. De tels inducteurs peuvent être des facteurs de croissance, des antibiotiques, des métaux, des acides aminés, ...et sont bien connus de l'homme de l'art.The presence in the culture medium of inductors can further increase the level of inducibility of the promoter. Such inducers may be growth factors, antibiotics, metals, amino acids, and are well known to those skilled in the art.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'induction du promoteur du gène Sox2 est renforcé par la présence des facteurs de croissance dans le milieu de culture, en particulier la combinaison bFGF (basic fibroblast growth factor) et EGF (epidermal growth factor).In a preferred embodiment of the invention, the induction of the promoter of the Sox2 gene is reinforced by the presence of growth factors in the culture medium, in particular the combination of bFGF (basic fibroblast growth factor) and EGF (epidermal growth). factor).

Le terme « séquence régulatrice 3' UTR » désigne des séquences d'acide nucléique situées en aval du codon stop de la séquence codante d'un gène. Ce type de séquence permet notamment de stabiliser un transcrit d'ARNm par la présence de régions riches en adénine et en uridine (AU-rich) ou encore de le déstabiliser par la présence de structures particulières. Les séquences régulatrices 3'UTR participent ainsi activement à la régulation de l'expression des gènes après leur transcription, notamment par le biais de la fixation de miRNA sur des sites spécifiques.The term "regulatory sequence 3 'UTR" refers to nucleic acid sequences located downstream of the stop codon of the coding sequence of a gene. This type of sequence makes it possible in particular to stabilize an mRNA transcript by the presence of regions rich in adenine and uridine (AU-rich) or to destabilize it by the presence of particular structures. The 3'UTR regulatory sequences thus participate actively in the regulation of gene expression after their transcription, in particular by means of miRNA binding at specific sites.

Le terme « séquence régulatrice 5' UTR » désigne des séquences d'acide nucléique situées en amont du codon d'initiation de la traduction d'un gène. Ce type de séquence permet de stabiliser un transcrit d'ARNm par la présence de structure type tige-boucles.The term "regulatory sequence 5 'UTR" refers to nucleic acid sequences located upstream of the translation initiation codon of a gene. This type of sequence makes it possible to stabilize an mRNA transcript by the presence of rod-loop type structure.

Les séquences régulatrices 5'UTR réguleraient ainsi l'efficacité de l'initiation de la traduction.The 5'UTR regulatory sequences would thus regulate the efficiency of the initiation of translation.

Dans la cassette d'expression selon l'invention, la séquence régulatrice 5'UTR est placée à l'extrémité 5' de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène.In the expression cassette according to the invention, the 5'UTR regulatory sequence is placed at the 5 'end of the nucleic acid sequence coding for the oncogene.

Les séquences régulatrices 5' UTR et 3' UTR désignent des séquences transcrites mais non traduites.The 5 'UTR and 3' UTR regulatory sequences designate transcribed but untranslated sequences.

Dans le procédé d'amplification cellulaire de l'invention, pour que l'action des séquences régulatrices 5'UTR et 3'UTR soit optimale, on préférera qu'elles soient issues du même gène.In the cell amplification method of the invention, for the action of the 5'UTR and 3'UTR regulatory sequences to be optimal, it will be preferred that they be derived from the same gene.

De préférence, la séquence régulatrice 3'UTR est issue du gène Sox2.Preferably, the 3'UTR regulatory sequence is derived from the Sox2 gene.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence régulatrice 3'UTR issue du gène 5ox2 comprend ou consiste en la séquence SEQID NO : 17, correspondant aux nucléotides 1371 à 2426 de la séquence NM_011443.3, ou un dérivé de celle-ci.In a particular embodiment of the invention, the 3'UTR regulatory sequence derived from the 5ox2 gene comprises or consists of the sequence SEQ ID NO: 17, corresponding to nucleotides 1371 to 2426 of the sequence NM-011443.3, or a derivative of that -this.

De préférence, la séquence régulatrice 5'UTR est issue du gène Sox2.Preferably, the 5'UTR regulatory sequence is derived from the Sox2 gene.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence régulatrice 5'UTR issue du gène Sox2 comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 18, correspondant aux nucléotides 1 à 411 de la séquence NM_011443.3, ou un dérivé de celle-ci.In a particular embodiment of the invention, the 5'UTR regulatory sequence derived from the Sox2 gene comprises or consists of the sequence SEQ ID NO: 18, corresponding to nucleotides 1 to 411 of the NM_011443.3 sequence, or a derivative of it.

Dans ce mode de réalisation préféré, la cassette d'expression de l'invention comprend plus particulièrement la séquence SEQ ID NO : 19 correspondant à la séquence d'acide nucléique codant pour N-Myc (région 295-1683 de SEQ ID NO : 1), le promoteur du gène Sox2 (SEQ ID NO : 11) comprenant les régions GBS1 (SEQ ID NO : 15) et GBS2 (SEQ ID NO : 16) et les séquences régulatrices 5’UTR (SEQ ID NO : 18) et 3'UTR (SEQ ID NO : 17) du gène Sox2.In this preferred embodiment, the expression cassette of the invention more particularly comprises the sequence SEQ ID NO: 19 corresponding to the nucleic acid sequence coding for N-Myc (region 295-1683 of SEQ ID NO: 1 ), the promoter of the Sox2 gene (SEQ ID NO: 11) comprising the regions GBS1 (SEQ ID NO: 15) and GBS2 (SEQ ID NO: 16) and the regulatory sequences 5'UTR (SEQ ID NO: 18) and 3 UTR (SEQ ID NO: 17) of the Sox2 gene.

Selon un mode de réalisation particulier, le procédé d'amplification cellulaire de l'invention comprend préalablement à l'étape a) une étape de transformation des progéniteurs neuronaux par ladite cassette d'expression.According to a particular embodiment, the cell amplification method of the invention comprises, prior to step a), a step of transforming the neuronal progenitors by said expression cassette.

Les méthodes de transformation cellulaires sont bien connues de l'homme de l'art et reposent notamment sur l'utilisation de solution de chlorure de calcium, de lipides et polycations naturels ou synthétiques, ou de virus. La magnétofection, l'électroporation, la biolistic, ou encore l'infection virale constituent les principales méthodes de transformation couramment utilisées pour obtenir l'expression exogène d'un gène d'intérêt dans une cellule de mammifère.Cell transformation methods are well known to those skilled in the art and rely in particular on the use of calcium chloride solution, natural or synthetic lipids and polycations, or viruses. Magnetofection, electroporation, biolistic, or viral infection are the main transformation methods commonly used to obtain the exogenous expression of a gene of interest in a mammalian cell.

Dans le cadre de la présente invention, la méthode de transformation cellulaire doit être compatible avec la nature des progéniteurs neuronaux.In the context of the present invention, the cell transformation method must be compatible with the nature of the neural progenitors.

Selon un mode de réalisation particulier, la transformation des progéniteurs neuronaux par la cassette d'expression de l'invention s'effectue par infection virale.According to a particular embodiment, the transformation of the neuronal progenitors by the expression cassette of the invention is carried out by viral infection.

Selon un mode de réalisation plus particulier, la transformation des progéniteurs neuronaux s'effectue à l'aide d'un lentivirus recombinant, lequel comprend la cassette d'expression de l'invention.According to a more particular embodiment, the transformation of the neuronal progenitors is carried out using a recombinant lentivirus, which comprises the expression cassette of the invention.

La sélection des progéniteurs neuronaux transformés par la cassette d'expression de l'invention est basée sur la détection du transgène N-myc/Sox2 (e.g.. par la technique PCR) intégré à l'ADN génomique des progéniteurs neuronaux, leur capacité à proliférer puis à se différencier en neurones et/ou en cellules gliales. D'autres modes de sélection des progéniteurs neuronaux transformés par la cassette d'expression de l'invention sont également envisageables. A titre d'exemple, l'introduction d'un gène de sélection en sus de la cassette d'expression dans un vecteur viral permet de conférer un avantage phénotypique aux seuls progéniteurs neuronaux transformés avec succès. D'une autre manière, la sélection des progéniteurs neuronaux transformés par la cassette d'expression de l'invention peut être effectuée par sélection clonale en réalisant des dilutions limites des progéniteurs neuronaux après leur transformation. De telles techniques de sélection sont bien connues de l'homme du métier.The selection of the neuronal progenitors transformed by the expression cassette of the invention is based on the detection of the N-myc / Sox2 transgene (eg by the PCR technique) integrated into the genomic DNA of the neuronal progenitors, their capacity to proliferate. then to differentiate into neurons and / or glial cells. Other modes of selection of neuronal progenitors transformed by the expression cassette of the invention are also conceivable. By way of example, the introduction of a selection gene in addition to the expression cassette into a viral vector makes it possible to confer a phenotypic advantage only on successful neuronal progenitors. In another manner, the selection of the neuronal progenitors transformed by the expression cassette of the invention may be carried out by clonal selection by carrying out limiting dilutions of the neuronal progenitors after their transformation. Such selection techniques are well known to those skilled in the art.

Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé est caractérisé en ce qu'il vise l'obtention de cellules nerveuses différenciées et en ce qu'il comprend en outre une étape supplémentaire b) de différenciation induite par une modification de la composition du milieu de culture utilisé à l'étape a) des progéniteurs neuronaux en neurones et/ou en cellules gliales choisies parmi les astrocytes et les oligodendrocytes.According to another particular embodiment of the invention, the method is characterized in that it aims at obtaining differentiated nerve cells and in that it further comprises an additional step b) of differentiation induced by a modification of the composition of the culture medium used in step a) neuronal progenitors in neurons and / or glial cells selected from astrocytes and oligodendrocytes.

Dans le procédé selon l'invention, les progéniteurs neuronaux se différencient en neurones et en cellules gliales. Les cellules gliales comportent des astrocytes (cellules protectrices et nourricières des neurones) et des oligodendrocytes qui forment un manchon isolant de myéline autour des axones des neurones. Il est donc possible d'obtenir un mélange de cellules différenciées à partir des progéniteurs neuronaux.In the method according to the invention, neuronal progenitors differentiate into neurons and glial cells. Glial cells contain astrocytes (protective and nerve cells of neurons) and oligodendrocytes that form an insulating sleeve of myelin around the axons of neurons. It is therefore possible to obtain a mixture of differentiated cells from neuronal progenitors.

La présence de cellules gliales est nécessaire pour assurer une maturation fonctionnelle des neurones, en particulier des neurones à GnRH, à partir des progéniteurs neuronaux.The presence of glial cells is necessary to ensure functional maturation of neurons, particularly GnRH neurons, from neuronal progenitors.

De préférence, la différenciation des progéniteurs neuronaux est induite par une modification de la composition du milieu de culture des progéniteurs neuronaux utilisée à l'étape a) du procédé de l'invention.Preferably, the differentiation of the neuronal progenitors is induced by a modification of the composition of the culture medium of the neuronal progenitors used in step a) of the method of the invention.

Dans un mode de réalisation particulier, la différenciation des progéniteurs neuronaux est initiée par le retrait de tous les facteurs mitogènes du milieu de culture. Ainsi, les facteurs de croissance, en particulier le bFGF et/ou l'EGF sont retirés du milieu de culture. L'initiation de la différenciation conduit à une extinction progressive de l'expression du gène Sox2 dans les progéniteurs neuronaux en cours de différenciation. Cette diminution de l'expression du gène Sox2 est aussi associée à celle de l'oncogène également sous contrôle du promoteur Sox2 de la cassette d'expression. L'oncogène n'est par conséquent plus exprimé dans les progéniteurs neuronaux qui ont initié leur différenciation ; le processus mitotique cessant au profit du processus de différenciation dans le cadre du procédé selon l'invention. D'autres facteurs secondaires de différenciation peuvent également être ajoutés au milieu de culture des progéniteurs neuronaux ayant entamé leur différenciation. De tels facteurs permettent de favoriser la différenciation en certaines sous-populations cellulaires et ainsi de réguler la proportion de cellules neuronales et/ou gliales ou, plus finement, la proportion respective d'astrocytes et d'oligodendrocytes.In a particular embodiment, the differentiation of neuronal progenitors is initiated by the removal of all the mitogenic factors from the culture medium. Thus, growth factors, in particular bFGF and / or EGF are removed from the culture medium. The initiation of differentiation leads to a gradual extinction of Sox2 gene expression in neuron progenitors undergoing differentiation. This decrease in the expression of the Sox2 gene is also associated with that of the oncogene also under the control of the Sox2 promoter of the expression cassette. The oncogene is therefore no longer expressed in the neuronal progenitors that initiated their differentiation; the mitotic process ceasing in favor of the differentiation process in the context of the process according to the invention. Other secondary differentiation factors can also be added to the culture medium of neuronal progenitors that have begun their differentiation. Such factors make it possible to promote differentiation in certain cellular subpopulations and thus to regulate the proportion of neuronal and / or glial cells or, more precisely, the respective proportion of astrocytes and oligodendrocytes.

La caractérisation des cellules différenciées peut être réalisée selon des techniques bien connues de l'homme de l'art, incluant des analyses morphologiques, des analyses par immunocytochimie, par RT-PCR et par des tests électrophysiologiques. Cette caractérisation a pour but de distinguer, au sein d'une population cellulaire hétérogène, les différents types cellulaires présents. Ainsi, les progéniteurs qui ne seront pas parvenus à entrer en différenciation, soit parce qu'ils n'ont pas été transformés par la cassette d'expression, soit parce qu'ils l'ont perdu, seront porteurs de marqueurs spécifiques de multipotence, en particulier de Sox2.Characterization of the differentiated cells can be carried out according to techniques well known to those skilled in the art, including morphological analyzes, immunocytochemical analyzes, RT-PCR and electrophysiological tests. This characterization aims to distinguish, within a heterogeneous cell population, the different cell types present. Thus, progenitors that have not been able to differentiate, either because they have not been transformed by the expression cassette, or because they have lost it, will carry specific markers of multipotency, especially Sox2.

Au cours de la différenciation, l'aspect morphologique des progéniteurs neuronaux évolue. Les cellules perdent leur aspect sphérique ou fibroblastique au profit de cellules possédant un corps cellulaires, des dendrites et un axone caractéristiques des neurones, et/ou au profit de cellules étalées, pavimenteuses ou dendritiques (les astrocytes), ou encore en cellules plus petites que les astrocytes (les oligodendrocytes). Les corps cellulaires des neurones possèdent une taille variant de 10 à 20 pm et ont une forme ovale ou fusiforme. Les dendrites émergent de l'un ou des deux pôles du corps cellulaires du neurone et l'axone naît soit à partir du soma, soit à partir des dendrites.During differentiation, the morphological aspect of neuronal progenitors evolves. The cells lose their spherical or fibroblastic aspect in favor of cells possessing a cell body, dendrites and a axon characteristic of neurons, and / or in favor of spreading, squamous or dendritic cells (astrocytes), or in cells smaller than astrocytes (oligodendrocytes). The cell bodies of neurons have a size ranging from 10 to 20 pm and have an oval or fusiform shape. The dendrites emerge from one or both poles of the neuron's cell body and the axon is born either from the soma or from the dendrites.

Parmi des marqueurs cellulaires caractéristiques des différents lignages cellulaires, on peut citer : - pour les neurones : Tubb3 (betalll-tubuline), microtubule-associated protein 2 (Map2), TuJ-1 (Neuron-specific class III beta-tubulin), pour les cellules gliales : glial fibrillary acidic protein (GFAP), fatty acid binding protein 7 (BLBP), S100 calcium binding protein B (SlOObeta) (astrocytes), 04 (oligodendrocytes).Among cellular markers characteristic of the various cell lineages, mention may be made of: for the neurons: Tubb3 (betalll-tubulin), microtubule-associated protein 2 (Map2), TuJ-1 (Neuron-specific class III beta-tubulin), for glial cells: glial fibrillary acidic protein (GFAP), fatty acid binding protein 7 (BLBP), S100 calcium binding protein B (SlOObeta) (astrocytes), 04 (oligodendrocytes).

La proportion des différentes populations cellulaires résultant de la différenciation des progéniteurs neuronaux peut être déterminée à l'aide d'un cytomètre en flux ou par immunocytochimie sur la base des marqueurs des différents lignages pré-cités.The proportion of the different cell populations resulting from the differentiation of the neuronal progenitors can be determined using a flow cytometer or by immunocytochemistry on the basis of the markers of the various lineages mentioned above.

Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention est caractérisé en ce qu'il vise en outre le criblage d'un composé perturbateur endocrinien et en ce qu'il comprend en outre les étapes de : c) mise en contact des cellules obtenues à l'issue de l'étape b) du procédé avec au moins un composé, i.e. potentiel perturbateur endocrinien, d) détermination de tout changement métabolique et/ou phénotypique des cellules résultant de la mise en contact avec ledit au moins un composé lors de l'étape c), et e) identification, en tant que composé perturbateur endocrinien, de tout composé ayant entraîné un changement métabolique et/ou phénotypique à l'issue de l'étape d).According to a preferred embodiment, the method of the invention is characterized in that it also aims at screening for an endocrine disrupting compound and in that it further comprises the steps of: c) bringing the cells obtained at the end of step b) of the method with at least one compound, the endocrine disrupting potential, d) determination of any metabolic and / or phenotypic change of the cells resulting from contact with said at least one compound during step c), and e) identifying, as endocrine disrupting compound, any compound that caused a metabolic and / or phenotypic change at the end of step d).

La contamination de l'environnement par des perturbateurs endocriniens constitue un véritable problème de santé publique. Les sources d'exposition aux perturbateurs endocriniens pour un individu sont multiples et interviennent notamment par les aliments ou les boissons qu'il consomme, les médicaments qu'il absorbe, les pesticides et les cosmétiques qu'il emploie. Ainsi, l'exposition aux perturbateurs endocriniens peut se faire par le régime alimentaire, l'air, l'eau et la peau.Contamination of the environment by endocrine disruptors is a real public health problem. Sources of endocrine disruptor exposure for an individual are multiple and include the food or beverages it consumes, the drugs it absorbs, pesticides and cosmetics it uses. Thus, exposure to endocrine disruptors can be done through diet, air, water and skin.

Bien que la présence de tels composés chimiques dans l'eau, l'air ou les sols et leurs effets délétères soient largement documentés, il existe un réel besoin de mettre au point des méthodes permettant leur détection et éventuellement la quantification de leurs effets pour mieux en appréhender leur incidence en termes de santé publique.Although the presence of such chemical compounds in water, air or soil and their deleterious effects are widely documented, there is a real need to develop methods for their detection and possibly the quantification of their effects for better to understand their impact in terms of public health.

Par « perturbateur endocrinien », on désigne une substance exogène ou un mélange de substances exogènes qui modifie les fonctions du système endocrinien et qui par conséquent induit des effets secondaires sur les organismes vivants, ou leur descendance. Généralement, ces substances sont des composés chimiques qui perturbent l'action hormonale. Leur structure leur permet soit de se fixer directement sur les récepteurs hormonaux, soit d'interférer avec des protéines qui participent à la maturation (i.e., aromatase) ou au guidage (Le., sodium/iodide symporter, cortisol binding protein) des hormones vers leur cible."Endocrine disruptor" means an exogenous substance or a mixture of exogenous substances which modifies the functions of the endocrine system and which consequently has side effects on living organisms, or their offspring. Generally, these substances are chemical compounds that disrupt the hormonal action. Their structure allows them either to attach directly to the hormone receptors, or to interfere with proteins that participate in the maturation (ie, aromatase) or guidance (Le., Sodium / iodide symporter, cortisol binding protein) hormones to their target.

Des listes non exhaustives de composés possédant un potentiel effet de perturbateur endocrinien ont été établies par l'OMS (cf. liste annexe II, pp 253-257 du document State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals - 2012), et par l'Union Européenne (cf. liste annexe X de la Directive 2013/39/UE).Non-exhaustive lists of compounds with a potential endocrine disruptor effect have been established by WHO (see Annex II, pp 253-257 of the State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals 2012), and by the European Union. European Union (see Annex X list of Directive 2013/39 / EU).

Par « criblage », on désigne l'ensemble des étapes qui permettent la mise en évidence des effets physiologiques d'un perturbateur endocrinien. Le terme criblage doit être entendu au sens de la présente invention comme l'identification, la détection mais aussi la quantification des effets de composés perturbateurs endocriniens.By "screening" is meant all of the steps that make it possible to demonstrate the physiological effects of an endocrine disruptor. For the purposes of the present invention, the term "screening" should be understood as the identification, detection and quantification of the effects of endocrine disrupting compounds.

Les progéniteurs neuronaux dérivés de la placode olfactive se différencient en neurones de type neurones à GnRH (gonadotropin-releasing hormone). Le GnRH est un décapeptide qui régule la sécrétion des gonadotrophines hypophysaires, en particulier de la FSH (Follicle Stimulating Hormone) et de la LH (Luteinizing Hormone) qui contrôlent la production de gamètes par les gonades et la synthèse d'hormones stéroïdes comme la progestérone ou les oestrogènes. Les taux de FSH et de LH augmentent à la puberté, sous l'influence de la LH-RH hypothalamique. Les taux de testostérone ou d'oestrogènes et de progestérone sont retro-inhibiteurs sur la FSH et la LH. Les neurones à GnRH jouent par conséquent un rôle essentiel dans la fonction de reproduction chez le mammifère.Neural progenitors derived from the olfactory placode are differentiated into GnRH (gonadotropin-releasing hormone) neurons. GnRH is a decapeptide that regulates the secretion of pituitary gonadotropins, in particular FSH (Follicle Stimulating Hormone) and LH (Luteinizing Hormone), which control gamete production by gonads and the synthesis of steroid hormones such as progesterone. or estrogen. FSH and LH levels increase at puberty, under the influence of hypothalamic LH-RH. Testosterone or estrogen and progesterone levels are retro-inhibitors on FSH and LH. GnRH neurons therefore play an essential role in mammalian reproductive function.

Le GnRH, synthétisé par les neurones à GnRH, se fixe sur des récepteurs transmembranaires présents à la surface des cellules gonadotropes. Cette fixation induit la transduction du signal aboutissant à la sécrétion hormonale. La présence d'un composé perturbateur endocrinien dans l'environnement des neurones à GnRH peut modifier la sécrétion des hormones sexuelles et ainsi être à l'origine d'un dysfonctionnement de la fonction reproductrice.GnRH, synthesized by GnRH neurons, binds to transmembrane receptors on the surface of gonadotropic cells. This binding induces signal transduction leading to hormonal secretion. The presence of an endocrine disrupting compound in the environment of GnRH neurons can alter the secretion of sex hormones and thus cause reproductive dysfunction.

La « mise en contact » des cellules dérivées des progéniteurs neuronaux résultant de l'étape b) du procédé selon l'invention avec au moins un composé suspecté d'être un perturbateur endocrinien signifie que ce composé est placé directement dans le milieu de culture de ces cellules.The "contacting" of cells derived from neuronal progenitors resulting from step b) of the method according to the invention with at least one compound suspected to be an endocrine disruptor means that this compound is placed directly in the culture medium of these cells.

La mise en contact peut être effectuée pendant un temps variant de quelques minutes à plusieurs jours, et en présence de concentrations variables du composé à tester.The contacting may be carried out for a time varying from a few minutes to several days, and in the presence of varying concentrations of the test compound.

De préférence, le composé à tester est incubé pendant 24-72 heures avec les cellules différenciées dérivées des progéniteurs neuronaux.Preferably, the test compound is incubated for 24-72 hours with differentiated cells derived from neuronal progenitors.

Par « changement métabolique et/ou phénotypique », on désigne toute modification détectable dans l'apparence, la présence de marqueurs spécifiques, les fonctions effectrices des cellules différenciées dérivées de progéniteurs neuronaux. Il s'agit notamment d'une modification de la morphologie cellulaire ou de la capacité à synthétiser du GnRH. La viabilité cellulaire pourra également être évaluée. L'identification de tout changement métabolique et/ou phénotypique des cellules différenciées dérivées des progéniteurs neuronaux mises en contact avec un composé suspecté d'être un perturbateur endocrinien est réalisée en les comparant avec ces mêmes cellules non traitées par ce composé.By "metabolic and / or phenotypic change" is meant any detectable change in appearance, the presence of specific markers, the effector functions of differentiated cells derived from neuronal progenitors. These include a change in cell morphology or the ability to synthesize GnRH. Cell viability can also be evaluated. The identification of any metabolic and / or phenotypic changes of differentiated cells derived from neuronal progenitors contacted with a compound suspected of being an endocrine disruptor is performed by comparing them with those same cells not treated with this compound.

Selon un mode de réalisation particulier, l'identification de tout changement métabolique et/ou phénotypique des cellules différenciées dérivées des progéniteurs neuronaux mises en contact avec un composé suspecté d'être un perturbateur endocrinien est réalisée en les comparant avec ces mêmes cellules traitées avec un composé déjà connu pour ces effets de perturbateurs endocriniens vis-à-vis des neurones à GnRH.According to a particular embodiment, the identification of any metabolic and / or phenotypic change of the differentiated cells derived from the neuronal progenitors brought into contact with a compound suspected of being an endocrine disruptor is carried out by comparing them with these same cells treated with a compound already known for these effects of endocrine disruptors vis-à-vis the GnRH neurons.

Compte tenu du fait que les perturbateurs endocriniens peuvent avoir des effets toxiques cumulatifs, l'incubation des cellules différenciées dérivées des progéniteurs neuronaux pourra être effectuée en présence de deux ou plusieurs composés suspectés d'être des perturbateurs endocriniens. Si les effets de ces composés sont synergiques alors les changements métaboliques ou phénotypiques seront d'autant plus accentués. En cas d'effet antagoniste des composés, il sera alors plus délicat d'obtenir une analyse tranchée.Given that endocrine disruptors may have cumulative toxic effects, the incubation of differentiated cells derived from neuronal progenitors may be performed in the presence of two or more compounds suspected to be endocrine disruptors. If the effects of these compounds are synergistic then the metabolic or phenotypic changes will be even more accentuated. In case of antagonistic effect of the compounds, it will then be more difficult to obtain a trench analysis.

Un autre objet de l'invention concerne une cassette d'expression comprenant : - une séquence d'acide nucléique codant pour un oncogène liée de manière opérationnelle à un promoteur inductible, ledit promoteur inductible comprenant : (i) une région promotrice minimale, et (ii) au moins une séquence régulatrice GBS (Gli-binding site), - et, optionnellement, une séquence régulatrice 5' UTR placée en amont de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène et/ou une séquence régulatrice 3' UTR placée à l'extrémité 3' de la séquence d'acide nucléique codant pour l'oncogène.Another subject of the invention relates to an expression cassette comprising: an oncogene coding nucleic acid sequence operably linked to an inducible promoter, said inducible promoter comprising: (i) a minimal promoter region, and ii) at least one GBS (Gli-binding site) regulatory sequence, and, optionally, a 5 'UTR regulatory sequence placed upstream of the nucleic acid sequence coding for the oncogene and / or a 3' UTR regulatory sequence placed at the 3 'end of the nucleic acid sequence encoding the oncogene.

De préférence, l'oncogène de la cassette d'expression est choisi parmi les gènes HRAS / KRAS et NRAS, Her2, Hdm2, N-myc, T ALI, Fli-1, MLL, C cycline Dl, RET, PML, Abl ou C-Myc.Preferably, the oncogene of the expression cassette is chosen from the genes HRAS / KRAS and NRAS, Her2, Hdm2, N-myc, T AL1, Fli-1, MLL, C cyclin D1, RET, PML, Abl or C-Myc.

Selon un mode de réalisation particulier, l'oncogène est le gène N-myc tel que défini précédemment par les séquences de référence SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :2 ; SEQ ID NO :3, SEQ ID NO :4 et SEQ ID NO :5.According to a particular embodiment, the oncogene is the N-myc gene as defined previously by the reference sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.

Selon un mode de réalisation plus particulier, l'oncogène N-myc utilisé dans la cassette selon l'invention est d'origine murine et correspond aux nucléotides 295 à 1683 de la séquence SEQ ID NO :1.According to a more particular embodiment, the N-myc oncogene used in the cassette according to the invention is of murine origin and corresponds to nucleotides 295 to 1683 of the sequence SEQ ID NO: 1.

La région promotrice minimale du promoteur inductible doit pouvoir être induite dans des progéniteurs neuronaux ou toute autre cellule possédant des éléments trans susceptibles d'activer cette région promotrice minimale.The minimal promoter region of the inducible promoter must be capable of being induced in neuronal progenitors or any other cell possessing trans elements capable of activating this minimal promoter region.

Selon un mode de réalisation particulier, la région promotrice minimale du promoteur inductible est issue du gène Sox2 et est définie par la séquence SEQ ID NO : 12 ou un dérivé de celle-ci.According to a particular embodiment, the minimal promoter region of the inducible promoter is derived from the Sox2 gene and is defined by the sequence SEQ ID NO: 12 or a derivative thereof.

La séquence régulatrice GBS (Gli-binding site) doit pouvoir être activée dans le contexte cellulaire des progéniteurs neuronaux. De telles cellules expriment fortement la protéine SOX2 dont on sait qu'elle participe à l'autorégulation du gène permettant son expression.The regulatory sequence GBS (Gli-binding site) must be able to be activated in the cellular context of neuronal progenitors. Such cells strongly express the SOX2 protein which is known to participate in the self-regulation of the gene allowing its expression.

Selon un mode de réalisation particulier, la au moins une séquence régulatrice GBS comprend ou consiste en une séquence GBS 1 (SEQ ID NO :15) ou GBS2 (SEQ ID NO : 16) du gène Sox2, ou un dérivé de celle-ci.According to a particular embodiment, the at least one GBS regulatory sequence comprises or consists of a sequence GBS 1 (SEQ ID NO: 15) or GBS2 (SEQ ID NO: 16) of the Sox2 gene, or a derivative thereof.

Lors du développement embryonnaire, une régulation optimale du gène 5ox2 est obtenue par l'action conjointe des éléments situés en régions 5' et 3' UTR. Dans le contexte de la cassette d'expression selon l'invention, une expression optimale de l'oncogène (p. ex. N-myc) pourra être obtenue en incluant une séquence régulatrice 3' UTR placée en aval du codon stop de la région codante de l'oncogène.During embryonic development, optimal regulation of the 5ox2 gene is obtained by the joint action of the elements located in the 5 'and 3' UTR regions. In the context of the expression cassette according to the invention, an optimal expression of the oncogene (eg N-myc) can be obtained by including a 3 'UTR regulatory sequence placed downstream of the stop codon of the region. coding of the oncogene.

Selon un mode de réalisation particulier, la séquence régulatrice 3' UTR placée en aval du codon stop de la région codante de l'oncogène N-myc est issue du gène Sox2 et a pour séquence SEQ ID NO : 17, ou un dérivé de celle-ci.According to a particular embodiment, the 3 'UTR regulatory sequence placed downstream of the stop codon of the coding region of the N-myc oncogene is derived from the Sox2 gene and has the sequence SEQ ID NO: 17, or a derivative thereof. -this.

Selon un mode de réalisation particulier, la séquence régulatrice 5' UTR placée en amont du codon d'initiation de la traduction de la région codante de l'oncogène N-myc est issue du gène Sox2 et a pour séquence SEQ ID NO : 18, ou un dérivé de celle-ci.According to one particular embodiment, the 5 'UTR regulatory sequence placed upstream of the translation initiation codon of the coding region of the N-myc oncogene is derived from the Sox2 gene and has the sequence SEQ ID NO: 18, or a derivative thereof.

Selon un mode de réalisation plus particulier, la cassette d'expression de l'invention comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 19. En particulier, cette cassette d'expression résulte de l'association des éléments suivants : une séquence régulatrice GBS 1 (SEQ ID NO : 15) et une séquence régulatrice GBS2 (SEQ ID NO : 16) du gène Sox2, la région promotrice minimale Sox2 et définie par la séquence SEQ ID NO : 12, la séquence codante de l'oncogène N-myc définie par les nucléotides 295 à 1683 de la séquence SEQ ID NO : 1 et les séquences régulatrices 5'UTR et 3' UTR issues du gèneAccording to a more particular embodiment, the expression cassette of the invention comprises or consists of the sequence SEQ ID NO: 19. In particular, this expression cassette results from the combination of the following elements: a GBS regulatory sequence 1 (SEQ ID NO: 15) and a regulatory sequence GBS2 (SEQ ID NO: 16) of the Sox2 gene, the minimal promoter region Sox2 and defined by the sequence SEQ ID NO: 12, the coding sequence of the N-myc oncogene defined by nucleotides 295 to 1683 of the sequence SEQ ID NO: 1 and the 5 'UTR and 3' UTR gene-derived regulatory sequences

Sox2 et ayant pour séquences SEQ ID NO : 18 et SEQ ID NO : 17 placées respectivement en amont de la région promotrice minimale et en aval du codon stop de la région codante de l'oncogène N-myc. L'invention a également pour objet un vecteur comprenant une cassette d'expression selon l'invention. Il peut s'agir d'un vecteur lipidique, d'un vecteur plasmidique ou encore d'un vecteur viral.Sox2 and having for sequence SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 17 placed respectively upstream of the minimal promoter region and downstream of the stop codon of the coding region of the N-myc oncogene. The subject of the invention is also a vector comprising an expression cassette according to the invention. It may be a lipid vector, a plasmid vector or a viral vector.

Il peut être éventuellement associé à une ou plusieurs substances améliorant l’efficacité transfectionnelle et/ou la stabilité du vecteur. Ces substances sont largement documentées dans la littérature accessible à l’homme de l’art (voir par exemple FELGNER et al., Proc. West. Pharmacol. Soc. 1987, 32, ppll5- 121; HODGSON & SOLAIMAN, Nature Biotechnology 1996, 14, pp339-342 ; REMY et al. , Bioconjugate Chemistry 1994, 5, pp647-654). A titre illustratif, mais non limitatif, il peut s'agir de polymères, de lipides, notamment cationiques, de liposomes, de protéines nucléaires ou encore de lipides neutres. Ces substances peuvent être utilisées seules ou en combinaison. Une combinaison envisageable est un vecteur recombinant plasmidique associé à des lipides cationiques (DOGS, DC-CHOL, spermine-chol, spermidine-chol etc.) et des lipides neutres (DOPE).It may be optionally combined with one or more substances that improve the transfection efficiency and / or the stability of the vector. These substances are widely documented in the literature accessible to those skilled in the art (see, for example, FELGNER et al., Proc., West, Pharmacol Soc., 1987, 32, ppl15, 121, HODGSON & SOLAIMAN, Nature Biotechnology 1996). 14, pp339-342, REMY et al., Bioconjugate Chemistry 1994, 5, pp647-654). By way of illustration, but not limitation, they may be polymers, lipids, in particular cationic, liposomes, nuclear proteins or even neutral lipids. These substances can be used alone or in combination. One conceivable combination is a plasmid recombinant vector associated with cationic lipids (DOGS, DC-CHOL, spermine-chol, spermidine-chol, etc.) and neutral lipids (DOPE).

Le choix des plasmides utilisables dans le cadre de la présente invention est vaste. Il peut s'agir de vecteurs de clonage et/ou d'expression. D'une manière générale, ils sont connus de l'homme de l'art et nombre d'entre eux sont disponibles commercialement mais il est également possible de les construire ou les modifier par les techniques de manipulation génétique. On peut citer à titre d'exemples les plasmides dérivés de pBR322 (GIBCO BRL), pUC (GIBCO BRL), pBluescript (STRATAGENE), pREP4, pCEP4 (IN VITROGEN) ou encore p Poly (LATHE et al., Gene 1987, 57, ppl93-201). De préférence, un plasmide mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention contient une origine de réplication assurant l'initiation de la réplication dans une cellule productrice et/ou une cellule hôte (par exemple, on retiendra l'origine ColEI pour un plasmide destiné à être produit dans E. coli et le système oriP/EBNAI si l'on désire qu'il soit autoreplicatif dans une cellule hôte mammifère, LUPTON & LEVINE, Mol. Cell. Biol. 1985, 5, pp2533-2542 ; YATES et al., Nature 1985, 313, pp812-815). Il peut en outre comprendre un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules transfectées (complémentation d'une mutation d'auxotrophie, gène codant pour la résistance à un antibiotique...)· H peut aussi comprendre des éléments supplémentaires améliorant son maintien et/ou sa stabilité dans une cellule donnée (séquence cer qui favorise le maintien monomérique d'un plasmide, séquences d'intégration dans le génome cellulaire). S'agissant d'un vecteur viral, on peut envisager un vecteur dérivant d'un adénovirus, d'un lentivirus, d'un rétrovirus, d'un virus associé à l'adénovirus (AAV), d'un virus de l'herpès, d'un alphavirus, d'un parvovirus, d'un poxvirus (fowlpox, canaripox, virus de la vaccine notamment de la souche MVA (Modified Virus Ankara) ou Copenhagen...) ou d'un foamyvirus. On aura de préférence recours à un vecteur non réplicatif. Les rétrovirus ont la propriété d'infecter et de s'intégrer majoritairement dans les cellules en division et à cet égard sont particulièrement appropriés pour le procédé d'amplification cellulaire de l'invention. Un vecteur rétroviral convenant à la mise en oeuvre de la présente invention comporte les séquences terminales LTR (Long Terminal Repeat) et une région d'encapsidation. Il peut dériver d'un rétrovirus d'une origine quelconque (murin, primate, félin, humain etc.) et en particulier peut dériver d'un rétrovirus choisi parmi le groupe comprenant MoMuLV (Moloney murine leukemia virus), MVS (Murine sarcoma virus) ou Friend murine rétrovirus (Fb29). Il est propagé dans une lignée d'encapsidation capable de fournir en trans les polypeptides viraux gag, pol et/ou env nécessaires à la constitution d'une particule virale. De telles lignées sont décrites dans la littérature (PA317, Psi CRIP GP + Am-12 etc.). Le vecteur rétroviral selon l'invention peut comporter des modifications notamment au niveau des LTRs (remplacement de la région promotrice par un promoteur eucaryote) ou de la région d'encapsidation (remplacement par une région d'encapsidation hétérologue, par exemple de type VL30) (voir les demandes de brevet français FR94/08300 et Fr 97/ 05203).The choice of plasmids that can be used in the context of the present invention is vast. They may be cloning and / or expression vectors. In general, they are known to those skilled in the art and many of them are commercially available but it is also possible to construct or modify them by genetic manipulation techniques. Examples that may be mentioned include plasmids derived from pBR322 (GIBCO BRL), pUC (GIBCO BRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (IN VITROGEN) or else Poly (LATHE et al., Gene 1987, 57). ppl93-201). Preferably, a plasmid used in the context of the present invention contains an origin of replication ensuring the initiation of replication in a producer cell and / or a host cell (for example, we will retain the ColEI origin for a plasmid intended to be produced in E. coli and the oriP / EBNAI system if it is desired to be self-replicative in a mammalian host cell, LUPTON & LEVINE, Mol Cell Biol 1985, 5, pp2533-2542; et al., Nature 1985, 313, pp812-815). It may furthermore comprise a selection gene making it possible to select or identify the transfected cells (complementation of an auxotrophic mutation, gene encoding resistance to an antibiotic, etc.). It may also comprise additional elements improving its maintenance. and / or its stability in a given cell (cer sequence which promotes the monomeric maintenance of a plasmid, integration sequences in the cellular genome). As regards a viral vector, a vector derived from an adenovirus, a lentivirus, a retrovirus, a virus associated with adenovirus (AAV), a virus of the herpes, an alphavirus, a parvovirus, a poxvirus (fowlpox, canaripox, vaccinia virus including MVA strain (Modified Virus Ankara) or Copenhagen ...) or a foamyvirus. A non-replicative vector will preferably be used. Retroviruses have the property of infecting and integrating mainly in dividing cells and in this respect are particularly suitable for the cell amplification method of the invention. A retroviral vector suitable for carrying out the present invention comprises the long terminal repeat (LTR) sequences and an encapsidation region. It can be derived from a retrovirus of any origin (murine, primate, feline, human, etc.) and in particular can be derived from a retrovirus selected from the group consisting of MoMuLV (Moloney murine leukemia virus), MVS (Murine sarcoma virus). ) or Friend murine retrovirus (Fb29). It is propagated in a packaging line capable of providing in trans the viral polypeptides gag, pol and / or env necessary for the constitution of a viral particle. Such lines are described in the literature (PA317, Psi CRIP GP + Am-12 etc.). The retroviral vector according to the invention may comprise modifications, in particular at the level of the LTRs (replacement of the promoter region by a eukaryotic promoter) or of the encapsidation region (replacement with a heterologous encapsidation region, for example of the VL30 type) (see French patent applications FR94 / 08300 and FR 97/05203).

En particulier, le choix du type de vecteur sera lié au choix des progéniteurs neuronaux.In particular, the choice of the type of vector will be linked to the choice of neuronal progenitors.

Selon un mode de réalisation particulier, le système du lentivirus est utilisé. Cette technique a l'avantage de permettre l'infection de cellules en division et de cellules quiescentes (non prolifératives) et est ainsi compatible avec le procédé d'amplification cellulaire de l'invention. De plus, un vecteur lentiviral permet au matériel génétique qu'il contient de s'intégrer dans le génome de la cellule cible ce qui facilite une expression à long terme de la protéine d'intérêt et facilite l'obtention de lignée stable.According to a particular embodiment, the lentivirus system is used. This technique has the advantage of allowing the infection of dividing cells and of quiescent (non-proliferative) cells and is thus compatible with the cellular amplification method of the invention. In addition, a lentiviral vector allows the genetic material it contains to integrate into the genome of the target cell which facilitates long term expression of the protein of interest and facilitates the obtaining of stable lineage.

Selon un mode de réalisation avantageux, le vecteur viral utilisé selon l'invention peut être sous la forme de vecteur ADN ou de particule virale infectieuse.According to an advantageous embodiment, the viral vector used according to the invention may be in the form of a DNA vector or an infectious viral particle.

La présente invention concerne également une cellule hôte comprenant un vecteur ou une cassette selon l'invention.The present invention also relates to a host cell comprising a vector or a cassette according to the invention.

Aux fins de la présente invention, une telle cellule est constituée par toute cellule susceptible d'être transformée par un vecteur tel que décrit ci-avant.For the purposes of the present invention, such a cell is constituted by any cell capable of being transformed by a vector as described above.

En particulier, une cellule de mammifère, peut être utilisée comme cellule hôte. Il peut s'agir d'une cellule primaire ou tumorale d'une origine quelconque, notamment les cellules souches de mammifères non humains ou les cellules issues de neuroblastome.In particular, a mammalian cell can be used as a host cell. It may be a primary or tumor cell of any origin, including nonhuman mammalian stem cells or cells derived from neuroblastoma.

De préférence, la cellule hôte est un progéniteur neuronal.Preferably, the host cell is a neuronal progenitor.

La présente invention a également pour objet un kit pour le criblage de composés perturbateurs endocriniens comprenant une cassette d'expression selon l'invention, et/ou un vecteur comprenant une telle cassette et/ou une cellule hôte transformée par une telle cassette ou un tel vecteur.The subject of the present invention is also a kit for the screening of endocrine disrupting compounds comprising an expression cassette according to the invention, and / or a vector comprising such a cassette and / or a host cell transformed by such a cassette or such a cassette. vector.

Enfin l'invention est également relative à l'utilisation d'une cassette d'expression, d'un vecteur, et/ou d'une cellule hôte transformée tels que définis précédemment pour le criblage de composés perturbateurs endocriniens ou de composés suspectés d'être des perturbateurs endocriniens, en particulier de composés perturbateurs endocriniens ou de composés suspectés d'être des perturbateurs endocriniens ciblant les neurones issus de la placode olfactive (neurones olfactifs et neurones à GnRH). L'invention est illustrée par les exemples suivants sans pour autant que le contenu de leur enseignement ne restreigne la portée de l'invention ni n'en constitue une limitation.Finally, the invention also relates to the use of an expression cassette, a vector, and / or a transformed host cell as defined above for the screening of endocrine disrupting compounds or compounds suspected of endocrine disruptors, in particular endocrine disrupting compounds or compounds suspected to be endocrine disruptors targeting olfactory placode neurons (olfactory neurons and GnRH neurons). The invention is illustrated by the following examples without the content of their teaching restricting the scope of the invention nor is it a limitation.

EXEMPLES 1 - Constructions de la cassette Sox2-N-MycEXAMPLES 1 - Constructions of the Sox2-N-Myc Cassette

La cassette Sox2-Nmyc a été entièrement synthétisée par extension d'amorces et clonée dans pKS-Bluescript. Des oligonucléotides de 40 mers chevauchants sur une longueur de 20 bases et couvrant la longueur du transgène ont été synthétisés puis assemblés par réaction de PCR.The Sox2-Nmyc cassette was fully synthesized by primer extension and cloned into pKS-Bluescript. Oligonucleotides of 40 overlapping seas over a length of 20 bases and covering the length of the transgene were synthesized and then assembled by PCR reaction.

La séquence de la cassette Sox2-Nmyc correspond à SEQID NO :19. 2 - Clonage de la cassette dans un vecteur d'expressionThe sequence of the Sox2-Nmyc cassette corresponds to SEQ ID NO: 19. 2 - Cloning of the cassette into an expression vector

Le clonage de la cassette Sox2-Nmyc correspondant à SEQ ID NO :19 dans un plasmide d'expression lentiviral a été réalisé en trois étapes.Cloning of the Sox2-Nmyc cassette corresponding to SEQ ID NO: 19 into a lentiviral expression plasmid was performed in three steps.

Un premier insert correspondant à l'extrémité 5' du promoteur Sox2 a été obtenu par coupure du plasmide Sox2p-Myc (figure 1) par les enzymes de restriction Mlul et Xhol. La ligation de cet insert dans le vecteur d'expression lentiviral pLV.EFl.MCS (figure 2) a été réalisée après la double digestion de celui-ci par les enzymes de restriction Mlul et Xhol. Cette première étape aboutit à l'obtention du plasmide pLV.5'prom.MCS.A first insert corresponding to the 5 'end of the Sox2 promoter was obtained by cleaving the Sox2p-Myc plasmid (FIG. 1) with the restriction enzymes Mlul and XhoI. The ligation of this insert into the lentiviral expression vector pLV.EF1.MCS (FIG. 2) was carried out after double digestion thereof with the restriction enzymes Mlul and XhoI. This first step results in obtaining plasmid pLV.5'prom.MCS.

Un amplicon correspondant à l'extrémité 3' de N-myc +3'UTR de Sox2 a été obtenu par amplification du plasmide pKS-Sox2-Nmyc à l'aide des amorces sens 5'-CTTGGTGGGTCGTCGAGTGCTAGCCACAC -3' (SEQ ID NO: 20) et anti-sens 5'-TACGCGTCGACTCTCAAACTGTGCATAATGGAGTAA -3' (SEQ ID NO :21). Ces amorces permettent également d'introduire respectivement les sites de clonage Nhel (GCTAGC) et Sali (gtcgac) dans l'amplicon. La ligation de l'amplicon ainsi obtenu est réalisée dans le plasmide pLV.S'prom.MCS. Cette seconde étape aboutit à l'obtention du plasmide pLV.5'Sox2prom.MCS.3'N-Myc.An amplicon corresponding to the 3 'end of N-myc + 3'UTR of Sox2 was obtained by amplification of the plasmid pKS-Sox2-Nmyc using primers sense 5'-CTTGGTGGGTCGTCGAGTGCTAGCCACAC -3' (SEQ ID NO: 20) and antisense 5'-TACGCGTCGACTCTCAAACTGTGCATAATGGAGTAA -3 '(SEQ ID NO: 21). These primers also make it possible to introduce respectively the NheI cloning sites (GCTAGC) and SalI (gtcgac) into the amplicon. The ligation of the amplicon thus obtained is carried out in the plasmid pLV.S'prom.MCS. This second step results in obtaining plasmid pLV.5'Sox2prom.MCS.3'N-Myc.

Un second insert correspondant à l'extrémité 3' du promoteur Sox2 et à l'extrémité 5' de N-Myc a été obtenu par coupure du plasmide pKS-Sox2-Nmyc par les enzymes de restriction Nhel et Mlul. La ligation de cet insert dans le vecteur d'expression lentiviral pLV.5'Sox2prom.MCS.3'N-Myc a été réalisée après la double digestion de celui-ci par les enzymes de restriction Nhel et Mlul. Cette troisième étape aboutit à l'obtention du plasmide pLV.SOX2prom.N-Myc-3'UTRSOX2 (figure 3). A chacune des étapes, les clones candidats sont sélectionnés et criblés par PCR. Les clones positifs sont mis en culture dans 4 ml de milieu LB+ampicilline puis séquencés entre les deux sites de clonages utilisés à chacune des étapes de la construction. 3 - Culture des progéniteurs neuronaux 3.1 - Isolement L'isolement des progéniteurs neuronaux à partir de placodes olfactives est effectué selon la méthode décrite par CONSTANTIN et al., Endocrinology 2009, vol.150 n°7:pp3221-3227. 20 à 25 placodes olfactives d'embryons Eli,5 sont placées dans un tubes de 2 mL avec lmL de PBS ou HBSS ou milieu Gey supplémenté en glucose (5mg/mL). 1 mL de milieu SFM est alors ajouté. Le milieu SFM est un mélange 50/50 des milieux de culture BME (Basal Medium Eagle, Invitrogen ref. 41010-026) et Ham's F-12 (Invitrogen ref. 11765-054), dans lequel sont ajoutés 1% de BSA (bovin sérum albumin, Sigma ref.A-9430/A-8806), 0,1 mM de putrescine (Sigma ref.P-7505), 5pg/ml d'insuline (Sigma ref.l-5500), 100 pg/ml de transferrine (Sigma ref.T-0178), 3.10'8M de sélénium (Sigma ref.S-1382), 2 mM de glutamine (Invitrogen ref.25030-081), 5mg/ml de glucose (Sigma ref.G-7021), 38 μΜ de de vitamine C (Sigma ref.A-4034) et un cocktail d'antibiotiques (Invitrogen ref. 15640-055) pénicilline (50 pg/ml)-streptomycine (50 pg/ml)-néomycine (100 pg/ml). Les concentrations indiquées sont les concentrations finales.A second insert corresponding to the 3 'end of the Sox2 promoter and the 5' end of N-Myc was obtained by cleaving the plasmid pKS-Sox2-Nmyc with the restriction enzymes NheI and Mlul. The ligation of this insert into the lentiviral expression vector pLV.5'Sox2prom.MCS.3'N-Myc was carried out after double digestion thereof with the restriction enzymes NheI and Mlul. This third step results in obtaining the plasmid pLV.SOX2prom.N-Myc-3'UTRSOX2 (FIG. 3). At each step, the candidate clones are selected and screened by PCR. The positive clones are cultured in 4 ml of LB + ampicillin medium and then sequenced between the two cloning sites used at each stage of the construction. 3 - Culture of neuronal progenitors 3.1 - Isolation The isolation of neuronal progenitors from olfactory placodes is carried out according to the method described by CONSTANTIN et al., Endocrinology 2009, vol.150 No. 7: pp3221-3227. 20 to 25 olfactory placodes of Eli embryos are placed in a 2 ml tubes with 1mL of PBS or HBSS or Gey medium supplemented with glucose (5mg / ml). 1 mL of SFM medium is then added. SFM medium is a 50/50 mixture of BME culture media (Basal Medium Eagle, Invitrogen ref 41010-026) and Ham's F-12 (Invitrogen ref 11765-054), in which 1% BSA (bovine) is added. albumin serum, Sigma ref.A-9430 / A-8806), 0.1 mM putrescine (Sigma ref.P-7505), 5 μg / ml insulin (Sigma ref.l-5500), 100 μg / ml of transferrin (Sigma ref.T-0178), 3.10'8M selenium (Sigma ref.S-1382), 2 mM glutamine (Invitrogen ref.25030-081), 5mg / ml glucose (Sigma ref.G-7021) , 38 μΜ of vitamin C (Sigma ref.A-4034) and a cocktail of antibiotics (Invitrogen ref 15640-055) penicillin (50 μg / ml) -treptomycin (50 μg / ml) -neomycin (100 μg / ml) ml). The concentrations indicated are the final concentrations.

La dissociation des cellules des placodes olfactives est effectuée par pipetages répétés : 50 pipetages avec P1000 et cône coupé (section plus grande), puis 50 pipetages avec P100 et cône non coupé, puis 50 pipetages avec P200 et cône non coupé. Le contenu du tube est filtré avec un filtre de 40μηι. Le tamisa est récupéré et transféré dans un tube à centrifuger de 50 ML. 3 mL de milieu SFM sont ajoutés dans le filtre afin d'améliorer le rendement du tamisage. Le tube de 50 ml contenant le tamisa est centrifugé à 155g pendant 5 minutes à température ambiante. Le surnageant est jeté et le culot cellulaire est remis en suspension dans 10 mL de milieu SFM. 3.2-TransductionThe dissociation of the olfactory placode cells is carried out by repeated pipetting: 50 pipetting with P1000 and cut cone (larger section), then 50 pipetting with P100 and uncut cone, then 50 pipetting with P200 and uncut cone. The content of the tube is filtered with a 40μηι filter. The sieve is recovered and transferred to a 50 ML centrifuge tube. 3 mL of SFM medium is added to the filter to improve the sieving yield. The 50 ml tube containing the sieve is centrifuged at 155 g for 5 minutes at room temperature. The supernatant is discarded and the cell pellet is resuspended in 10 mL of SFM medium. 3.2-Transduction

Les cellules fraîchement dissociées de placodes olfactives sont ensemencées à une densité de 200 000 cellules/mL. Ces cellules sont infectées par un lentivirus comprenant la cassette d'expression Sox2-Nmyc de l'invention selon une MOI égale à 10 en présence de polybrène (4pg/mL) dans du milieu SFM. Après 24 heures d'incubation à 37°C et 5% C02, la totalité du milieu de culture est renouvelée par du milieu SFM supplémenté en sérum de poulet 1% (Sigma C5405), en bFGF 20ng/mL (Preprotech AF100-15) et EGF 20ng/mL (Gibco 13256). 4 - Différenciation des progéniteurs neuronaux en neurones et cellules glialesFreshly dissociated cells from olfactory placodes are seeded at a density of 200,000 cells / mL. These cells are infected with a lentivirus comprising the Sox2-Nmyc expression cassette of the invention in a MOI equal to 10 in the presence of polybrene (4 μg / ml) in SFM medium. After 24 hours of incubation at 37 ° C. and 5% CO 2, the entire culture medium is renewed with SFM medium supplemented with 1% chicken serum (Sigma C5405) in 20 ng bFGF / ml (Preprotech AF100-15). and EGF 20 ng / mL (Gibco 13256). 4 - Differentiation of Neuronal Progenitors in Neurons and Glial Cells

La différenciation des progéniteurs neuronaux en neurones et cellules gliales est induite par un remplacement progressif du milieu de culture SFM supplémenté en sérum de poulet (1%), en bFGF (20ng/mL) et EGF (20ng/mL) par du milieu Neurocuit : DMEM/F12 (Gibco 21041); B27 (Gibco 17504) IX ; péni-strepto (Gibco 150170) ; Insuline 25pg/mL (Sigma 15500) ; D-Glucose 6g/L (Sigma G7021) ; EGF 20ng/mL (Preprotech AF100-15) ; bFGF 20ng/mL (Gibco 13256). La cinétique de remplacement est effectuée selon le schéma suivant : ¾ milieu SFM - Ά milieu Neurocuit pendant 24 heures puis A milieu SFM - A milieu Neurocuit pendant 24 heures puis A milieu SFM - ¾ milieu Neurocuit pendant 24 heures. Après 24 heures de culture en milieu Neurocuit, les facteurs de croissance EGF et bFGF sont retirés.The differentiation of neuronal progenitors into neurons and glial cells is induced by a progressive replacement of the SFM culture medium supplemented with chicken serum (1%), bFGF (20 ng / ml) and EGF (20 ng / ml) with Neurocuit medium: DMEM / F12 (Gibco 21041); B27 (Gibco 17504) IX; penis strepto (Gibco 150170); Insulin 25 μg / mL (Sigma 15500); D-Glucose 6g / L (Sigma G7021); EGF 20 ng / mL (Preprotech AF100-15); bFGF 20ng / mL (Gibco 13256). The replacement kinetics are performed according to the following scheme: ¾ medium SFM - Ά medium Neurocuit for 24 hours then A medium SFM - A medium Neurocuit for 24 hours then A middle SFM - ¾ medium Neurocuit for 24 hours. After 24 hours of culture in a Neurocuit medium, the EGF and bFGF growth factors are removed.

La caractérisation des cellules différenciées est effectuée par immunohistochimie. La détection des antigènes Tuj-1 (protéine spécifique de neurones) et GFAP (protéine spécifique des cellules gliales) est réalisée après 10 jours de culture en condition de différenciation d'un clone de progéniteur neuronal transduit avec le transgène pS0X2-Nmyc. Comme le montre la figure 4 (grossissement : panneaux A, B et C : X20 ; panneaux D,E et F : X40), la présence des neurones est vérifiée par immunodétection de l'antigène Tuj-1 (B et E). La présence de cellules gliales est réalisée par l'immunodétection de l'antigène GFAP (C et D). La densité cellulaire est indiquée par la détection de l'ADN nucléaire après révélation au Dapi. 5 - Criblage de composés perturbateurs endocriniens sur les cellules dérivées de progéniteurs neuronaux • Prolifération cellulaire :Characterization of differentiated cells is performed by immunohistochemistry. The detection of antigens Tuj-1 (neuron-specific protein) and GFAP (glial-specific protein) is carried out after 10 days of culture in a differentiation condition of a neuronal progenitor clone transduced with the transgene pS0X2-Nmyc. As shown in Figure 4 (magnification: panels A, B and C: X20, panels D, E and F: X40), the presence of neurons is verified by immunodetection of Tuj-1 antigen (B and E). The presence of glial cells is achieved by immunodetection of the GFAP antigen (C and D). The cell density is indicated by the detection of nuclear DNA after Dapi revelation. 5 - Screening of endocrine disrupting compounds on cells derived from neuronal progenitors • Proliferation of cells:

Ces tests pourront être réalisés sur les cellules en condition de prolifération ou de différenciation. Les tests couramment utilisés en toxicologie réglementaire sont : - incorporation d'iodure de propidium, - marquage Ki67, PCNA, BrdU après incorporation. • Viabilité cellulaire :These tests may be performed on cells in proliferative or differentiating conditions. The tests commonly used in regulatory toxicology are: - incorporation of propidium iodide, - Ki67 labeling, PCNA, BrdU after incorporation. • Cell viability:

Ces tests pourront être réalisés sur les cellules en condition de prolifération ou de différenciation. Les tests couramment utilisés en toxicologie réglementaire sont : - relargage de Bleu Trypan, - incorporation de rouge neutre. • Mortalité cellulaire :These tests may be performed on cells in proliferative or differentiating conditions. The tests commonly used in regulatory toxicology are: - release of Trypan Blue, - incorporation of neutral red. • Cell mortality:

Ces tests pourront être réalisés sur les cellules en condition de prolifération ou de différenciation. Les tests couramment utilisés en toxicologie réglementaire sont : - mesure d'Annexin V par cytométrie en flux, -TUNEL. • Vitesse de différenciation cellulaire : L'impact du xénobiotique à tester sur la vitesse de différenciation sera mesurée à partir de la cinétique d'apparition des neurones et cellules gliales (détectables après marquage Tuj-1 et GFAP).These tests may be performed on cells in proliferative or differentiating conditions. The tests commonly used in regulatory toxicology are: - Annexin V measurement by flow cytometry, - TUNEL. • Cellular differentiation rate: The impact of xenobiotic to be tested on the rate of differentiation will be measured from the kinetics of appearance of neurons and glial cells (detectable after labeling Tuj-1 and GFAP).

Le ratio neurones/cellules gliales pourra être déterminé. • Morphologie des cellules différenciées :The ratio of neurons to glial cells can be determined. • Morphology of differentiated cells:

La morphologie (taille et forme) globale sera évaluée, la taille des prolongements neuronaux et gliaux sera mesurée ainsi que leur ramification. • Activité électrique et sécrétrice :The morphology (size and shape) overall will be evaluated, the size of the neuronal and glial extensions will be measured as well as their branching. • Electrical and secretory activity:

Par des mesures électrophysiologiques, la fonction neuronale pourra être évaluée. Une mesure de calcium intracellulaire permettra d'évaluer l'activité sécrétrice des neurones. • Transcriptome/épigénome :By electrophysiological measurements, the neuronal function can be evaluated. Measurement of intracellular calcium will make it possible to evaluate the secretory activity of the neurons. • Transcriptome / epigenome:

Les gènes dont l'expression sera perturbée seront détectés par des techniques de transcriptome.Genes whose expression will be disrupted will be detected by transcriptome techniques.

Les modifications de marques épigénétiques (méthylation de l'ADN, modification post-traductionnelle des histones) pourront être évaluées.Epigenetic mark modifications (DNA methylation, post-translational modification of histones) can be evaluated.