JP2023090959A - Method for producing stem cell, and method of reducing risk of transforming into cancer cell - Google Patents

To provide a method for producing a stem cell conveniently without gene introduction.SOLUTION: A method for producing a stem cell includes a step of culturing a somatic cell in a culture medium containing a histone deacetylase inhibitor, wherein the method may include a step of inhibiting JDP2 gene of a cancer cell by RNA interference.SELECTED DRAWING: None

本発明は、幹細胞の製造方法、及び癌細胞化のリスク低減方法に関する。本発明によれば、幹細胞を容易に作製することができる。また、幹細胞が癌を形成するリスクを低減することが可能である。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing stem cells and a method for reducing the risk of cancer cell transformation. According to the present invention, stem cells can be easily produced. It is also possible to reduce the risk of stem cells forming cancer.

近年、生体外での培養により、細胞を所望の組織や器官を分化させ、そして治療に利用する再生医療が注目されつつある。しかしながら、ヒトにおいては、受精胚を破壊して作製される胚性幹細胞（embryonic stem cell：ＥＳ細胞）は、倫理面で問題がある。また、他家ＥＳ細胞を移植医療に用いる場合、移植後の免疫性拒絶反応が起きることがある。
一方、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：ｉＰＳ細胞）は、４因子（ＯＣＴ－３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ）を、体細胞に導入することにより誘導される細胞であり、ＥＳ細胞に似た形質及び遺伝子発現様式を有する。ｉＰＳ細胞は、マウスやヒトの線維芽細胞に、レトロウイルスベクター（特許文献１、非特許文献１、２）、又はプラスミド（非特許文献３）を用いて、４因子を細胞に導入することによって得られる。
ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞が有する倫理面の問題及び免疫性拒絶反応の問題を解決できる。しかしながら、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞ともに、その細胞生物学的特徴として、癌細胞に特異的な癌遺伝子（ｃ－ＭＹＣ等）が発現し、テラトーマ形成能力を有している。更に、ｃ－ＭＹＣを強制発現させた場合、ヒト上皮様細胞が初期化されて、容易に発癌性の高い幹細胞様細胞に誘導されるとの報告がある（非特許文献４）。従って、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を再生医療に応用する場合には、これらの細胞の癌化を抑制することが必須となる。 In recent years, attention has been focused on regenerative medicine in which cells are cultured in vitro to differentiate into desired tissues or organs and used for treatment. However, in humans, embryonic stem cells (ES cells) produced by destroying fertilized embryos have ethical problems. In addition, when allogeneic ES cells are used in transplantation medicine, immune rejection may occur after transplantation.
On the other hand, induced pluripotent stem cells (induced pluripotent stem cells: iPS cells) are 4 factors (OCT-3/4, SOX2, KLF4, c-MYC), cells induced by introducing into somatic cells , have traits and gene expression patterns similar to ES cells. iPS cells are mouse or human fibroblasts, retroviral vectors (Patent Document 1, Non-Patent Documents 1, 2), or plasmids (Non-Patent Document 3) are used to introduce four factors into cells. can get.
iPS cells can solve the ethical and immune rejection problems of ES cells. However, both ES cells and iPS cells express cancer cell-specific oncogenes (c-MYC, etc.) and have the ability to form teratoma, as their cell biological characteristics. Furthermore, there is a report that when c-MYC is forcibly expressed, human epithelial-like cells are reprogrammed and easily induced into highly carcinogenic stem cell-like cells (Non-Patent Document 4). Therefore, when applying ES cells and iPS cells to regenerative medicine, it is essential to suppress canceration of these cells.

一方、ｉＰＳ細胞作製時に、上記４因子と共に、ｐ５３遺伝子の抑制剤を併用することにより作製効率を上げる試みが行われている（非特許文献５）。また、発癌遺伝子ｃ－Ｊｕｎは、体細胞の初期化を妨げるとの報告（非特許文献６）が有る。 On the other hand, at the time of iPS cell production, attempts have been made to increase production efficiency by using a p53 gene inhibitor in combination with the above four factors (Non-Patent Document 5). There is also a report that the oncogene c-Jun interferes with reprogramming of somatic cells (Non-Patent Document 6).

本発明者らは、上記ｉＰＳ細胞の報告がなされる以前に、羊膜由来ヒト幹細胞の樹立方法について報告している（特許文献２、非特許文献７～９）。当該方法により樹立されたヒト幹細胞は、生体内培養系又は生体外培養系における分化転換制御メカニズムの解明、並びに分子生物学及び発生学の研究材料として有用であり、更には臓器移植用の臓器作製用細胞材料としても有用である。また、本発明者らは、ｉＰＳ細胞樹立法を簡便化して、ＯＣＴ－４プラスミドベクターの単独導入による、ウシｉＰＳ細胞の作製に成功している（非特許文献１０）。
更に多能性幹（ＰＳ）細胞を、遺伝物質を用いず、分子量の小さな蛋白質を使用して化学的に初期化する方法により作製する試みが行われている（非特許文献１１）。そこでは、細胞の生命活動上後成的な修飾が行われる際に重要な役割を果たす、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）や、ＤＮＡメチル基転移酵素（ＤＮＭＴ）に対する低分子インヒビターがｉＰＳ細胞への初期化誘導剤として使われている（非特許文献１２）。 The present inventors reported on a method for establishing amnion-derived human stem cells before the iPS cells were reported (Patent Document 2, Non-Patent Documents 7 to 9). Human stem cells established by this method are useful as research materials for the elucidation of transdifferentiation control mechanisms in in vivo or in vitro culture systems, molecular biology and embryology, and furthermore, organ preparation for organ transplantation. It is also useful as a cell material for use. In addition, the present inventors have simplified the iPS cell establishment method and succeeded in producing bovine iPS cells by introducing an OCT-4 plasmid vector alone (Non-Patent Document 10).
Furthermore, attempts have been made to prepare pluripotent stem (PS) cells by chemically reprogramming them using proteins with small molecular weights without using genetic material (Non-Patent Document 11). There, low-molecular-weight inhibitors against histone deacetylase (HDAC) and DNA methyltransferase (DNMT), which play an important role in epigenetic modification of cell vitality, are transferred to iPS cells. (Non-Patent Document 12).

特許第５０９８０２８号公報Japanese Patent No. 5098028 特開２００５－１５１９０７号公報JP-A-2005-151907

Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676 (2006).Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676 (2006). Takahashi K, et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872 (2007).Takahashi K, et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872 (2007). Okita K, et al., Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science 322, 949-953 (2008).Okita K, et al., Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science 322, 949-953 (2008). Poli V, et al., MYC-driven epigenetic reprogramming favours the onset of tumorigenesis by inducing a stem-like state. Nature communications 9, 1024(2018).Poli V, et al., MYC-driven epigenetic reprogramming favors the onset of tumorigenesis by inducing a stem-like state. Nature communications 9, 1024(2018). Krizhanovsky V, Lowe SW. Stem cells: the promises and perils of p53. Nature 460, 1085-1086 (2009).Krizhanovsky V, Lowe SW. Stem cells: the promises and perils of p53. Nature 460, 1085-1086 (2009). Lin J, et al., The oncogene c-Jun impedes somatic cell reprogramming. Nat Cell Biol 17, 856-867 (2015).Lin J, et al., The oncogene c-Jun impedes somatic cell reprogramming. Nat Cell Biol 17, 856-867 (2015). Saito S, et al., Derivation and induction of the differentiation of animal ES cells as well as human pluripotent stem cells derived from fetal membrane. Hum Cell 18，135-141 (2005).Saito S, et al., Derivation and induction of the differentiation of animal ES cells as well as human pluripotent stem cells derived from fetal membrane. Hum Cell 18, 135-141 (2005). Saito S, et al., Human amnion-derived cells as a reliable source of stem cells. Curr Mol Med 12, 1340-1349 (2012).Saito S, et al., Human amnion-derived cells as a reliable source of stem cells. Curr Mol Med 12, 1340-1349 (2012). Lin YC, et al., Role of tumor suppressor genes in the cancer-associated reprogramming of human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy 5, 58-66 (2014).Lin YC, et al., Role of tumor suppressor genes in the cancer-associated reprogramming of human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy 5, 58-66 (2014). Wang SW, et al., Androgen receptor-mediated apoptosis in bovine testicular induced pluripotent stem cells in response to phthalate esters. Cell Death & Disease 4, e907 (2013).Wang SW, et al., Androgen receptor-mediated apoptosis in bovine testicular induced pluripotent stem cells in response to phthalate esters. Cell Death & Disease 4, e907 (2013). Hou PP, et al., Pluripotent stem cell induced from mouse somaticcells by small-molecule compounds. Science 341, 651-654 (2013).Hou PP, et al., Pluripotent stem cell induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds. Science 341, 651-654 (2013). Lu JY, et al., Application of eigenome-modifying small moleculesin induced pluripotent stem cells. Med Res Rev 33, 790-822 (2013).Lu JY, et al., Application of eigenome-modifying small moleculesin induced pluripotent stem cells. Med Res Rev 33, 790-822 (2013).

従来のｉＰＳ細胞の作製においては、遺伝子を核酸断片として細胞に導入する。従って、対象細胞において、前記核酸断片がランダムにゲノムに挿入されるリスク、又は特異的なインテグレーションのリスクが存在する。すなわち、ｉＰＳ細胞は、癌細胞化する可能性があり、再生医療への応用を阻む要因となっていた。
本発明の目的は、遺伝子導入を伴うことなく、簡便に幹細胞を製造する方法を提供することである。また、本発明の目的は、幹細胞の癌細胞化のリスクを低減する方法を提供することである。 In conventional iPS cell production, genes are introduced into cells as nucleic acid fragments. Therefore, there is a risk of the nucleic acid fragment being randomly inserted into the genome or of specific integration in the subject cell. In other words, iPS cells have the potential to become cancerous cells, which has been a factor preventing their application to regenerative medicine.
An object of the present invention is to provide a method for easily producing stem cells without gene transfer. Another object of the present invention is to provide a method for reducing the risk of stem cells becoming cancer cells.

本発明者は、簡便な幹細胞の製造方法、及び幹細胞の癌細胞化のリスクを低減する方法ついて、鋭意研究した結果、驚くべきことに、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を用いること、又はＪＤＰ２遺伝子のＲＮＡ干渉により、幹細胞を製造できること、及び幹細胞の癌細胞化のリスクを低減できることを見出した。
具体的には、ヒドロキサム酸を添加した培地中で細胞を浮遊培養又は接着培養を７日～１４日間続けると、高率で幹細胞に誘導できた。幹細胞はＳＴＡＴ３及びＧＡＴＡ４を発現していた。また誘導された幹細胞の癌細胞化が抑制されていた。更に、ＪＤＰ２遺伝子のｍＲＮＡ相補的低分子ＲＮＡベクターを含む溶液に細胞を分散させ、前記細胞分散液を入れた電極容器に直流パルスを通電することにより、細胞の初期化が起こった。その後、浮遊培養又は接着培養を１０日～１４日間続けると、数％の割合で多能性幹細胞に誘導できた。それらの幹細胞はＳＴＡＴ３、及びＧＡＴＡ４を発現していた。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］体細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、幹細胞の製造方法、
［２］前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、スベロイルビスヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、酪酸、バルプロ酸、アピシジン、オキサムフラチン（Oxamflatin）、又はスプリトマイシン（Splitomicin）である、［１］に記載の幹細胞の製造方法、
［３］前記幹細胞が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＳＴＡＴ３、及びＧＡＴＡ４からなる群から選択される少なくとも１つの幹細胞マーカーを発現する、［１］又は［２］に記載の幹細胞の製造方法、
［４］［１］～［３］のいずれかの製造方法による癌細胞化のリスク低減方法、
［５］癌細胞のＪＤＰ２遺伝子をＲＮＡ干渉による抑制する工程を含む、幹細胞の製造方法、
［６］前記ＲＮＡ干渉が、癌細胞にＪＤＰ２遺伝子のｍＲＮＡの相補的低分子ＲＮＡベクターを導入することによって実施される、［５］に記載の幹細胞の製造方法、
［７］前記幹細胞が、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＳＴＡＴ３、及びＧＡＴＡ４からなる群から選択される少なくとも１つの幹細胞マーカーを発現する、［５］又は［６］に記載の幹細胞の製造方法、及び
［８］［１］～［３］及び［５］～［７］のいずれかに記載の製造方法によって得られる幹細胞、
に関する。 As a result of intensive research on a simple method for producing stem cells and a method for reducing the risk of cancer cell transformation of stem cells, the present inventor surprisingly found that a histone deacetylase inhibitor or a JDP2 gene RNA interference can produce stem cells and reduce the risk of stem cells becoming cancer cells.
Specifically, cells were induced into stem cells at a high rate when suspension culture or adhesion culture was continued for 7 to 14 days in a medium supplemented with hydroxamic acid. Stem cells expressed STAT3 and GATA4. In addition, cancer cell transformation of the induced stem cells was suppressed. Furthermore, cells were reprogrammed by dispersing the cells in a solution containing a low-molecular-weight RNA vector complementary to the mRNA of the JDP2 gene, and applying a DC pulse to the electrode container containing the cell dispersion. Subsequently, when suspension culture or adhesion culture was continued for 10 to 14 days, pluripotent stem cells could be induced at a rate of several percent. Those stem cells expressed STAT3 and GATA4.
The present invention is based on these findings.
Accordingly, the present invention provides
[1] A method for producing stem cells, comprising the step of culturing somatic cells in a medium containing a histone deacetylase inhibitor,
[2] The histone deacetylase inhibitor according to [1], wherein the histone deacetylase inhibitor is suberoylbishydroxamic acid, trichostatin A, butyric acid, valproic acid, apicidin, oxamflatin, or splitomicin. a method for producing stem cells,
[3] Production of stem cells according to [1] or [2], wherein the stem cells express at least one stem cell marker selected from the group consisting of OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, STAT3, and GATA4. Method,
[4] A method for reducing the risk of cancer cell transformation by the production method of any one of [1] to [3],
[5] A method for producing stem cells, comprising a step of suppressing the JDP2 gene of cancer cells by RNA interference;
[6] The method for producing stem cells according to [5], wherein the RNA interference is performed by introducing a small RNA vector complementary to the mRNA of the JDP2 gene into cancer cells.
[7] Production of stem cells according to [5] or [6], wherein the stem cells express at least one stem cell marker selected from the group consisting of OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, STAT3, and GATA4. and [8] Stem cells obtained by the production method according to any one of [1] to [3] and [5] to [7],
Regarding.

本発明の幹細胞の製造方法によれば、遺伝子導入を伴うこと無く、体細胞又は癌細胞から幹細胞を誘導することができる。また、本発明の癌細胞化のリスク低減方法によれば、細胞が癌細胞化することを抑制することができる。 According to the method for producing stem cells of the present invention, stem cells can be induced from somatic cells or cancer cells without gene transfer. Moreover, according to the method for reducing the risk of cancer cell transformation of the present invention, cancer cell transformation can be suppressed.

ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２のＪＤＰ２遺伝子の電気刺激処置を伴うｍＲＮＡ転写抑制による幹細胞様コロニーの顕微鏡写真（倍率１００倍）である。Fig. 10 is a photomicrograph (100x magnification) of stem cell-like colonies due to mRNA transcriptional repression associated with electrical stimulation treatment of the JDP2 gene of human hepatoma cell HepG2. ＨｅｐＧ２細胞のＪＤＰ２遺伝子転写抑制により誘導された幹細胞様細胞において、幹細胞マーカー（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＳＴＡＴ３、ＧＡＴＡ４）に対する抗体を反応させた結果を示す顕微鏡写真（倍率１００倍）である。Micrographs (100x magnification) showing the results of reacting stem cell-like cells induced by JDP2 gene transcription suppression in HepG2 cells with antibodies against stem cell markers (OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, STAT3, GATA4). be. ＨｅｐＧ２細胞由来幹細胞様細胞を免疫不全マウスに移植して形成されたテラトーマ組織標本の顕微鏡写真である。（Ａ）は外胚葉由来組織の顕微鏡写真（倍率４００倍）、（Ｂ）は中胚葉由来組織の顕微鏡写真（倍率２００倍）、（Ｃ）は内胚葉由来組織の顕微鏡写真（倍率２００倍）をそれぞれ示す。1 is a micrograph of a teratoma tissue specimen formed by transplanting HepG2 cell-derived stem cell-like cells into an immunodeficient mouse. (A) is a micrograph of ectoderm-derived tissue (400x magnification), (B) is a micrograph of mesoderm-derived tissue (200x magnification), and (C) is a micrograph of endoderm-derived tissue (200x magnification). respectively. ＨｅｐＧ２細胞の実施例１におけるグループ（１）及び（２）の細胞を免疫不全マウスに移植後、形成された４頭中２頭のテラトーマの写真である。FIG. 2 shows photographs of teratomas formed in two out of four immunodeficient mice after the cells of groups (1) and (2) in Example 1 of HepG2 cells were transplanted. ヒト繊維芽細胞ＮＨＤＦのヒドロキサム酸処理後、誘導された幹細胞様コロニーの顕微鏡写真（倍率１００倍）である。（Ａ）は処理前の細胞、（Ｂ）は幹細胞様形態を示す。Photomicrograph (100x magnification) of stem cell-like colonies induced after hydroxamic acid treatment of human fibroblast NHDF. (A) shows cells before treatment, (B) shows stem cell-like morphology. ＮＨＤＦ細胞をヒドロキサム酸処理することにより誘導された幹細胞様細胞において幹細胞マーカー（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＳＴＡＴ３、ＧＡＴＡ４）に対する抗体を反応させた結果を示す顕微鏡写真（倍率１００倍）であるMicrographs (100x magnification) showing the results of reaction of stem cell-like cells induced by hydroxamic acid treatment of NHDF cells with antibodies against stem cell markers (OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, STAT3, GATA4). be ヒトＮＨＤＦ細胞由来幹細胞様細胞を免疫不全マウス睾丸に移植し、３０日後に摘出した睾丸の写真である（Ａ）。対象としてマウスＥＳ細胞を同免疫不全マウスに移植後、摘出したテラトーマを形成した睾丸の写真である（Ｂ）。(A) is a photograph of a testicle excised 30 days after transplantation of human NHDF cell-derived stem cell-like cells into an immunodeficient mouse testicle. (B) is a photograph of a testis with teratoma, which was excised after transplantation of mouse ES cells into the same immunodeficient mouse as a subject. ヒトＮＨＤＦ細胞由来幹細胞様細胞から体外培養により分化させた胚葉体組織標本の顕微鏡写真（倍率４００倍）である。（Ａ）は外胚葉組織（神経膠様）、（Ｂ）は中胚葉組織（消化管内皮様）、（Ｃ）は内胚葉組織（肝細胞様）、（Ｄ）は胚葉体（倍率１００倍）写真をそれぞれ示す。It is a micrograph (400x magnification) of an embryoid body tissue sample differentiated from human NHDF cell-derived stem cell-like cells by in vitro culture. (A) Ectodermal tissue (glia-like), (B) Mesoderm tissue (gut endothelium-like), (C) Endoderm tissue (hepatocyte-like), (D) Embryoid body (100x magnification) ) show the pictures respectively. ヒト羊膜細胞のヒドロキサム酸処理により誘導された幹細胞様コロニーの顕微鏡写真である（倍率１００倍）。Photomicrograph of stem cell-like colonies induced by hydroxamic acid treatment of human amniotic cells (100x magnification). ヒト羊膜細胞由来幹細胞様細胞において、幹細胞マーカー（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＳＴＡＴ３、ＧＡＴＡ４）の発現をＲＴ－ＰＣＲ解析により確認した電気泳動写真である。Fig. 3 is an electrophoresis photograph showing expression of stem cell markers (OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, STAT3, GATA4) in human amniocyte-derived stem-like cells confirmed by RT-PCR analysis. ヒト羊膜細胞由来幹細胞様細胞のアルカリフォスファターゼ染色を示す顕微鏡写真（倍率４０倍）である。Fig. 3 is a micrograph (40x magnification) showing alkaline phosphatase staining of human amniocyte-derived stem cell-like cells. ヒト羊膜細胞由来幹細胞様細胞から分化させた外胚葉組織（神経様細胞）、中胚葉組織（血球前駆細胞）及び内胚葉組織（肝細胞様細胞）、に対して各種マーカー蛋白質に対する抗体を反応させた結果を示す顕微鏡写真（倍率２００倍）である。（Ａ）～（Ｃ）は、神経様細胞に対して、ネスチン抗体（Ａ）、ＧＦＡＰ抗体（Ｂ）、又はＴｕｊｉ１抗体（Ｃ）を反応させた結果を示す。（Ｄ）は、血球前駆細胞に対してＣＤ４５抗体を反応させた結果を示し、（Ｅ）は、幹細胞様細胞に対して、α－フェトプロテイン抗体を反応させた結果を示す。Ectodermal tissue (nerve-like cells), mesoderm tissue (blood cell progenitor cells) and endoderm tissue (hepatocyte-like cells) differentiated from human amniocyte-derived stem cell-like cells are reacted with antibodies against various marker proteins. It is a micrograph (magnification of 200 times) which shows the result. (A) to (C) show the results of reaction of neural-like cells with nestin antibody (A), GFAP antibody (B), or Tuji1 antibody (C). (D) shows the results of reacting blood progenitor cells with CD45 antibody, and (E) shows the results of reacting stem cell-like cells with α-fetoprotein antibody. ヒト羊膜細胞由来幹細胞様細胞を免疫不全マウス睾丸に移植し、３５日後に摘出した睾丸の写真である（Ａ）。対照としてマウスＥＳ細胞を同免疫不全マウスに移植後、摘出したテラトーマを形成した睾丸の写真である（Ｂ）。(A) is a photograph of a testicle excised 35 days after transplantation of human amniocyte-derived stem cell-like cells into an immunodeficient mouse testicle. (B) is a photograph of a testis with teratoma, which was excised after transplantation of mouse ES cells into the same immunodeficient mouse as a control.

《幹細胞の製造方法：実施態様１》
本発明の幹細胞の製造方法は、体細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む培地で培養する工程を含む。 <<Method for Producing Stem Cells: Embodiment 1>>
The method for producing stem cells of the present invention includes a step of culturing somatic cells in a medium containing a histone deacetylase inhibitor.

（体細胞）
本発明の幹細胞の製造方法に用いる体細胞は、動物の体細胞である限りにおいて、特に限定されるものではなく、例えば外胚葉由来組織の体細胞、中胚葉由来組織の体細胞、又は内胚葉由来組織の体細胞が挙げられる。具体的には、線維芽細胞、上皮細胞（皮膚表皮細胞、口腔粘膜上皮細胞、気道粘膜上皮細胞、又は腸管粘膜上皮細胞）、表皮細胞、歯肉細胞（歯肉線維芽細胞、又は歯肉上皮細胞）、歯髄細胞、白色脂肪細胞、皮下脂肪、内臓脂肪、筋肉、血液細胞又は羊膜由来細胞などが挙げられ、好ましくは線維芽細胞、表皮細胞（ケラチノサイト）、羊膜由来細胞などが挙げられる。また、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪組織由来間質細胞、脂肪組織由来間質幹細胞、神経幹細胞、精子幹細胞などの組織幹細胞（体性幹細胞）を体細胞として用いてもよく、又はそれらから分化誘導された組織前駆細胞、繊維芽細胞、上皮細胞、リンパ球、又は筋肉細胞を体細胞として用いてもよい。更に、間葉系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、腸幹細胞、皮膚幹細胞、毛包幹細胞、色素細胞幹細胞などの体性幹細胞から分化誘導し、あるいは脱分化させ、あるいはリプログラミングさせて作成した体細胞を用いてもよい。 (somatic cells)
The somatic cells used in the method for producing stem cells of the present invention are not particularly limited as long as they are animal somatic cells. Somatic cells of the tissue of origin are included. Specifically, fibroblasts, epithelial cells (skin epidermal cells, oral mucosal epithelial cells, airway mucosal epithelial cells, or intestinal mucosal epithelial cells), epidermal cells, gingival cells (gingival fibroblasts, or gingival epithelial cells), Examples include dental pulp cells, white adipocytes, subcutaneous fat, visceral fat, muscle, blood cells, and amnion-derived cells, preferably fibroblasts, epidermal cells (keratinocytes), and amnion-derived cells. In addition, tissue stem cells (somatic stem cells) such as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, adipose tissue-derived stromal cells, adipose tissue-derived stromal stem cells, neural stem cells, and spermatogonial stem cells may be used as somatic cells. Differentiation-induced tissue progenitor cells, fibroblasts, epithelial cells, lymphocytes, or muscle cells may be used as somatic cells. Furthermore, somatic cells prepared by differentiation induction, dedifferentiation, or reprogramming from somatic stem cells such as mesenchymal stem cells, neural stem cells, hepatic stem cells, intestinal stem cells, skin stem cells, hair follicle stem cells, melanocyte stem cells, etc. may be used.

体細胞が由来する動物は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。体細胞が由来する動物としては、例えばヒト又はヒト以外の動物（例えば、哺乳類）が挙げられる。ヒト以外の動物としては、例えばマウス若しくはラットなどの齧歯類、ウシ若しくはヒツジなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、イヌ若しくはネコなどの食肉類等、又はサル若しくはチンパンジーなどの霊長類；等の任意の哺乳類が挙げられるが、好ましくはヒト又はヒト以外の霊長類である。 Animals from which somatic cells are derived are not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the purpose. Animals from which somatic cells are derived include, for example, humans and non-human animals (eg, mammals). Non-human animals include, for example, rodents such as mice or rats, artiodactyls such as cows or sheep, peri-hoofed animals such as horses, carnivores such as dogs or cats, or primates such as monkeys or chimpanzees; etc., preferably humans or non-human primates.

前記繊維芽細胞は、公知の方法により、動物個体から採取して培養したものであってよい。例えば、培養繊維芽細胞は、Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1994)等に記載の方法により作製することができる。また、繊維芽細胞は、既存の細胞株であってもよい。繊維芽細胞の細胞株は、例えば、理化学研究所細胞バンク等から入手してもよく、市販のものを用いてもよい。 The fibroblasts may be those collected from an individual animal and cultured by a known method. For example, cultured fibroblasts can be prepared by the method described in Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1994). Fibroblasts may also be existing cell lines. Fibroblast cell lines may be obtained from, for example, RIKEN Cell Bank, etc., or commercially available ones may be used.

本明細書において「羊膜由来細胞」とは、羊膜から採取した細胞である。羊膜由来細胞は、羊膜から採取した細胞を、初代培養した繊維芽細胞であってもよい（特許文献２、非特許文献４～６参照）。羊膜由来細胞は、液体窒素保管器中で凍結保存されたものであってもよい。羊膜由来細胞は、好ましくは霊長類由来の細胞である。 As used herein, the term "amniotic membrane-derived cells" refers to cells collected from the amniotic membrane. The amniotic membrane-derived cells may be fibroblasts obtained by primary culture of cells collected from the amniotic membrane (see Patent Document 2 and Non-Patent Documents 4 to 6). The amnion-derived cells may be cryopreserved in a liquid nitrogen storage device. The amnion-derived cells are preferably primate-derived cells.

（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤）
本発明の幹細胞の製造方法においては、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の存在下で、体細胞を培養する。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、特に限定されるものではないが、スベロイルビスヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、酪酸、バルプロ酸、アピシジン、オキサムフラチン（Oxamflatin）、又はスプリトマイシン（Splitomicin）が挙げられる。 (histone deacetylase inhibitor)
In the method for producing stem cells of the present invention, somatic cells are cultured in the presence of a histone deacetylase inhibitor. Histone deacetylase inhibitors include, but are not limited to, suberoylbishydroxamic acid, trichostatin A, butyric acid, valproic acid, apicidin, oxamflatin, or splitomicin.

（スベロイルビスヒドロキサム酸）
スベロイルビスヒドロキサム酸は、分子量２０４．２の下記式（１）

（Ｃ_８Ｈ_１６Ｎ_２Ｏ_４）で表される化合物である。本発明の製造方法の培養時におけるスベロイルビスヒドロキサム酸の濃度は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば５μＭ～５０μＭであり、好ましくは５０μＭ～１ｍＭである。また、スベロイルビスヒドロキサム酸の濃度は、例えば１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであり、好ましくは１０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬである。 (suberoyl bishydroxamic acid)
Suberoyl bishydroxamic acid has the following formula (1) with a molecular weight of 204.2

It is a compound represented _by ( _{C8H16N2O4 ) .} The concentration of suberoylbishydroxamic acid during culture in the production method of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are obtained, but is, for example, 5 μM to 50 μM, preferably 50 μM to 1 mM. be. Also, the concentration of suberoylbishydroxamic acid is, for example, 1 μg/mL to 10 μg/mL, preferably 10 μg/mL to 200 μg/mL.

（トリコスタチンＡ）
トリコスタチンＡは、下記式（２）

で表される化合物である。本発明の製造方法の培養時におけるトリコスタチンＡの濃度は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば５μＭ～５０μＭであり、好ましくは５μＭ～５０μＭである。また、トリコスタチンＡの濃度は、例えば１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであり、好ましくは１０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬである。トリコスタチンＡは、クラスＩおよびＩＩほ乳類ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）ファミリーに属する酵素を選択的に阻害する。 (Trichostatin A)
Trichostatin A has the following formula (2)

It is a compound represented by The concentration of trichostatin A during culture in the production method of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are obtained, but is, for example, 5 μM to 50 μM, preferably 5 μM to 50 μM. Also, the concentration of trichostatin A is, for example, 1 μg/mL to 10 μg/mL, preferably 10 μg/mL to 200 μg/mL. Trichostatin A selectively inhibits enzymes belonging to the class I and II mammalian histone deacetylase (HDAC) family.

（酪酸）
酪酸は、下記式（３）

で表される化合物である。本発明の製造方法の培養時における酪酸の濃度は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば５μＭ～５０μＭであり、好ましくは５μＭ～５０μＭである。また、酪酸の濃度は、例えば１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであり、好ましくは１０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬである。 (butyric acid)
Butyric acid is represented by the following formula (3)

It is a compound represented by The concentration of butyric acid during culturing in the production method of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained, but is, for example, 5 μM to 50 μM, preferably 5 μM to 50 μM. Also, the concentration of butyric acid is, for example, 1 μg/mL to 10 μg/mL, preferably 10 μg/mL to 200 μg/mL.

（バルプロ酸）
バルプロ酸は、下記式（４）

で表される化合物である。本発明の製造方法の培養時におけるバルプロ酸の濃度は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば５μＭ～５０μＭであり、好ましくは５μＭ～５０μＭである。また、バルプロ酸の濃度は、例えば１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであり、好ましくは１０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬである。 (valproic acid)
Valproic acid is represented by the following formula (4)

It is a compound represented by The concentration of valproic acid during culture in the production method of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are obtained, but is, for example, 5 μM to 50 μM, preferably 5 μM to 50 μM. Also, the concentration of valproic acid is, for example, 1 μg/mL to 10 μg/mL, preferably 10 μg/mL to 200 μg/mL.

（アピシジン）
アピシジンは、下記式（５）

で表される化合物である。本発明の製造方法の培養時におけるアピシジンの濃度は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば５μＭ～５０μＭであり、好ましくは５μＭ～５０μＭである。また、アピシジンの濃度は、例えば１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであり、好ましくは１０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬである。 (Apicidin)
Apicidin is represented by the following formula (5)

It is a compound represented by The concentration of apicidin during culture in the production method of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are obtained, but is, for example, 5 μM to 50 μM, preferably 5 μM to 50 μM. Also, the concentration of apicidin is, for example, 1 μg/mL to 10 μg/mL, preferably 10 μg/mL to 200 μg/mL.

（スプリトマイシン）
スプリトマイシンは、下記式（６）

で表される化合物である。本発明の製造方法の培養時におけるスプリトマイシンの濃度は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば５μＭ～５０μＭであり、好ましくは５μＭ～５０μＭである。また、スプリトマイシンの濃度は、例えば１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであり、好ましくは１０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬである。 (Spritomycin)
Splitomycin is represented by the following formula (6)

It is a compound represented by The concentration of splitomycin during culture in the production method of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are obtained, but is, for example, 5 μM to 50 μM, preferably 5 μM to 50 μM. Also, the concentration of splitomycin is, for example, 1 μg/mL to 10 μg/mL, preferably 10 μg/mL to 200 μg/mL.

（オキサムフラチン）
オキサムフラチンは、下記式（７）

で表される化合物である。本発明の製造方法の培養時におけるオキサムフラチンの濃度は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば５μＭ～５０μＭであり、好ましくは５μＭ～５０μＭである。また、オキサムフラチンの濃度は、例えば１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬであり、好ましくは１０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬである。 (oxamflatin)
Oxamflatin has the following formula (7)

It is a compound represented by The concentration of oxamflatin during culture in the production method of the present invention is not particularly limited as long as the effects of the present invention are obtained, but is, for example, 5 μM to 50 μM, preferably 5 μM to 50 μM. Also, the concentration of oxamflatin is, for example, 1 μg/mL to 10 μg/mL, preferably 10 μg/mL to 200 μg/mL.

本発明の製造方法における体細胞の培養方法は、幹細胞の培養方法として通常実施されているものであれば、特に限定されるものではない。培地としては、幹細胞の培養に用いられているものを、限定せずに使用することができるが、例えばＤＭＥＭ培地、又はＭＥＭ－α培地を用いることができる。更に、牛胎児血清（ＦＣＳまたはＦＢＳ）、牛新生児血清（ＮＢＣＳ）、ヒト血清、血清代替物、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、骨形成蛋白因子４（ＢＭＰ４）、及びインスリン成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）からなる群より選択される少なくとも１種を含んでもよい。すなわち、ＭＥＭ－α培地又はＤＭＥＭ培地等の公知の培地に、前記成分を添加した培地を好適に用いることができる。培地中の前記各成分の濃度は、幹細胞の培養に通常用いられる濃度とすればよく、例えばＦＣＳ、ＦＢＳ、ＮＢＣＳ、ヒト血清、血清代替物の濃度としては５～１０％（Ｖ／Ｖ）、ＬＩＦ、ＢＭＰ４、ＩＧＦＢＰ３の濃度としては５～２０ｎｇ／ｍＬが挙げられる。
培養期間は、幹細胞が製造できる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば、３～３０日であり、好ましくは７～２０日であり、更に好ましくは１０～１４日である。細胞の増殖に応じて２～６日おきに、適宜、継代、又は培地交換を行ってもよい。
培養温度も、特に限定されるものではないが、例えば３５～３８℃であり、好ましくは３６．５～３７．５℃であり、より好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ_２濃度条件としては、例えば４～６％であり、好ましくは約５％である。 The method for culturing somatic cells in the production method of the present invention is not particularly limited as long as it is a method commonly practiced as a method for culturing stem cells. As the medium, those used for culturing stem cells can be used without limitation, and for example, DMEM medium or MEM-α medium can be used. In addition, fetal bovine serum (FCS or FBS), neonatal bovine serum (NBCS), human serum, serum substitutes, leukemia inhibitory factor (LIF), bone morphogenetic protein factor 4 (BMP4), and insulin growth factor binding protein 3 (IGFBP3) ) may include at least one selected from the group consisting of That is, a known medium such as MEM-α medium or DMEM medium supplemented with the above components can be suitably used. The concentration of each component in the medium may be the concentration normally used for culturing stem cells. Concentrations of LIF, BMP4, and IGFBP3 include 5-20 ng/mL.
The culture period is not particularly limited as long as stem cells can be produced, but is, for example, 3 to 30 days, preferably 7 to 20 days, more preferably 10 to 14 days. Depending on the growth of the cells, passage or medium exchange may be performed every 2 to 6 days as appropriate.
The culture temperature is also not particularly limited, but is, for example, 35 to 38°C, preferably 36.5 to 37.5°C, more preferably about 37°C. Also, the CO ₂ concentration condition is, for example, 4 to 6%, preferably about 5%.

培養の形態も、特に限定されるものではないが、浮遊培養が挙げられる。例えば、公知の方法であるポリ２－ヒドロキシエチルメタクリレート（ポリＨＥＭＡ）を培養皿に塗布することで、細胞を接着させずに培養することが可能である（Kuroda et al., PNAS USA 107, 8639-8643, 2010）。具体的には、エチルアルコール４０ｍＬ中に６０ｍｇのポリＨＥＭＡを溶解したものを、直径３．５ｃｍ培養皿に８００μＬ宛注入し、クリーンベンチの中で一晩乾燥させた後、細胞浮遊用培養皿として用いることができる。
また、本発明の製造方法における培養は、接着培養によって行うこともできる。 The form of culture is also not particularly limited, but suspension culture can be mentioned. For example, cells can be cultured without adhering by applying poly-2-hydroxyethyl methacrylate (poly-HEMA), which is a known method, to a culture dish (Kuroda et al., PNAS USA 107, 8639). -8643, 2010). Specifically, 800 μL of 60 mg of poly-HEMA dissolved in 40 mL of ethyl alcohol was injected into a culture dish with a diameter of 3.5 cm, dried overnight on a clean bench, and then used as a culture dish for cell suspension. can be used.
Cultivation in the production method of the present invention can also be performed by adherent culture.

ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を用いる幹細胞の培養方法の具体例を以下に記載する。体細胞を、細胞接着性を阻害するためにポリＨＥＭＡを塗布した培養容器（例えば直径３．５ｃｍ培養皿等）に播種する。培地として、スベロイルビスヒドロキサム酸を１００μｇ／ｍＬの濃度で添加した幹細胞用培地等を用い培養する。細胞は培養皿に接着すること無く、浮遊状態のまま増殖し、３～４日後には細胞数が１０個以上の細胞塊を形成する。適時培地交換を行い（例えば１～２日に１度）、更に培養を継続する。細胞塊の直径が、数１００μｍまで拡大し、ＥＳ細胞由来の胚葉体の様に中心部分の細胞が黒色化する前に、接着性を有する通常の培養容器に移し替える。以降は培養を継続して、ＥＳ様細胞コロニーが多数出現した時点で、トリプシン処理により、細胞を培養皿から剥離させ、遠心分離により細胞を回収する。回収した細胞は再び浮遊培養を続けてもよく、接着培養を継続してもよい。培養を繰り返すことにより、ＥＳ様細胞の形態を有するコロニーが多数出現する。これらのＥＳ細胞様細胞は、幹細胞の特徴を有し、多分化能を有する幹細胞である。 A specific example of a method for culturing stem cells using a histone deacetylase inhibitor is described below. Somatic cells are seeded in culture vessels (eg, 3.5 cm diameter culture dishes, etc.) coated with poly-HEMA to inhibit cell adhesion. As a medium, a medium for stem cells or the like supplemented with suberoyl bishydroxamic acid at a concentration of 100 μg/mL is used for culturing. The cells proliferate in a floating state without adhering to the culture dish, and after 3 to 4 days form cell clusters with 10 or more cells. The medium is replaced at appropriate times (for example, once every 1 to 2 days), and the culture is continued. Before the diameter of the cell mass expands to several 100 μm and the cells in the central portion turn black like ES cell-derived embryoid bodies, the cells are transferred to a normal culture vessel having adhesiveness. Thereafter, the culture is continued, and when a large number of ES-like cell colonies appear, the cells are detached from the culture dish by trypsinization, and the cells are recovered by centrifugation. The collected cells may be again subjected to suspension culture or adhesion culture. By repeating the culture, many colonies having ES-like cell morphology appear. These ES cell-like cells have stem cell characteristics and are multipotent stem cells.

（幹細胞マーカー）
本発明の製造方法によって得られた幹細胞は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＳＴＡＴ３、及びＧＡＴＡ４からなる群から選択される少なくとも１つの幹細胞マーカーを発現する。
ＯＣＴ４（Octamer-binding transcription factor 4）は、ＰＯＵ５Ｆ１（POU domain, class 5, transcription factor 1）とも呼ばれるヒトのタンパク質である。Ｏｃｔ－４はＰＯＵ（Ｐｉｔ－Ｏｃｔ－Ｕｎｃ）ドメインをもつＰＯＵファミリーのホメオドメイン転写因子であり、未分化肺性幹細胞の自己複製に関与し、多能性の維持に関与していると考えられている。
Ｓｏｘ２はＳｏｘＢ１ファミリーに属する転写因子であり、ＥＳ細胞やＴＳ細胞、更には神経幹細胞などで幹細胞性の維持に機能していることが知られている。
ｃ－ＭＹＣは、山中らがｉＰＳ細胞を誘導するために用いた因子の一つであり、ある種の遺伝子の転写を抑制する。また、ｃ－ＭＹＣは細胞増殖や細胞の成長の促進に不可欠な役割を示す。
ＫＬＦ４は、ジンク・フィンガー転写因子であり、ヒト及びマウスの多能性幹細胞の作成のための因子として用いられる。
ＳＴＡＴ３は、自己再生および幹細胞の生存及び増殖に関与していることが知られている。
ＧＡＴＡ４は、骨格筋幹細胞の分化及び増殖を制御すると考えられている。
本発明の製造方法によって得られた幹細胞は、前記の少なくとも１つの幹細胞マーカーを発現しており、多分化能を有する幹細胞であると考えられる。 (stem cell marker)
Stem cells obtained by the production method of the present invention express at least one stem cell marker selected from the group consisting of OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, STAT3, and GATA4.
OCT4 (Octamer-binding transcription factor 4) is a human protein also called POU5F1 (POU domain, class 5, transcription factor 1). Oct-4 is a POU family homeodomain transcription factor having a POU (Pit-Oct-Unc) domain, and is thought to be involved in self-renewal of undifferentiated pulmonary stem cells and maintenance of pluripotency. ing.
Sox2 is a transcription factor belonging to the SoxB1 family, and is known to function in maintaining stemness in ES cells, TS cells, neural stem cells, and the like.
c-MYC is one of the factors used by Yamanaka et al. to induce iPS cells, and suppresses the transcription of certain genes. c-MYC also plays an essential role in promoting cell proliferation and cell growth.
KLF4 is a zinc finger transcription factor and is used as a factor for the generation of human and mouse pluripotent stem cells.
STAT3 is known to be involved in self-renewal and stem cell survival and proliferation.
GATA4 is believed to regulate skeletal muscle stem cell differentiation and proliferation.
The stem cells obtained by the production method of the present invention express at least one stem cell marker described above and are considered to be multipotent stem cells.

（分化誘導）
本発明の製造方法によって得られた幹細胞は、所望の細胞に分化誘導することができる。幹細胞を分化誘導する方法は、分化を示す細胞に応じて、適宜公知の方法を選択することができる。
例えば、浮遊培養法により幹細胞に胚葉体様細胞塊を形成させた後、ＦＧＦ２及びＥＧＦ等を含むＤＭＥＭ培地等で接着培養することにより、アストロサイト細胞マーカー及び神経細胞マーカーであるＧＦＡＰ又はネスチンに対する抗体に陽性反応を示す神経細胞に分化させることができる。
また、同様に幹細胞に胚葉体様細胞塊を形成させた後、ＦＣＳ及び／又はアスコルビン酸等を含むＤＭＥＭ培地等で接着培養することにより、心筋マーカーであるＭＹＬ２、ＧＡＴＡ４、ＮＫＸ２．５等に対する各抗体に陽性反応を示す心筋細胞に分化させることができる。
また、幹細胞に胚葉体様細胞塊を形成させた後、ＦＢＳ、Ａｃｔｉｎ－Ａ等を含むＤＭＥＭ培地等で接着培養することにより、α－フェトプロテイン抗体又はＨＮＦ－４α等に対する抗体に陽性反応を示す肝細胞に分化させることができる。 (differentiation induction)
Stem cells obtained by the production method of the present invention can be induced to differentiate into desired cells. As a method for inducing differentiation of stem cells, a known method can be appropriately selected according to cells exhibiting differentiation.
For example, stem cells are allowed to form embryoid body-like cell clusters by a suspension culture method, followed by adherent culture in a DMEM medium containing FGF2, EGF, etc. to obtain an antibody against GFAP or nestin, which is an astrocyte cell marker and neuronal cell marker. can be differentiated into neurons that positively react to
Similarly, stem cells are allowed to form embryoid body-like cell clusters, and then adherently cultured in a DMEM medium containing FCS and/or ascorbic acid, etc., to obtain the results for myocardial markers such as MYL2, GATA4, and NKX2.5. They can be differentiated into cardiomyocytes that positively react with antibodies.
In addition, after allowing the stem cells to form embryoid body-like cell clusters, by adhering and culturing them in DMEM medium containing FBS, Actin-A, etc., a liver that exhibits a positive reaction to α-fetoprotein antibodies or antibodies to HNF-4α, etc. It can be differentiated into cells.

（癌細胞化のリスク低減方法）
本発明の幹細胞の製造方法によって、癌細胞化のリスクを低減することができる。
本発明の癌細胞化のリスク低減方法によって得られた癌細胞化リスク低減化幹細胞は、（ａ）正常２倍体の核型を有する。（ｂ）未分化状態で３０回以上、好ましくは４０回以上の継代が可能である。（ｃ）アルカリフォスファターゼ活性を有し、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＳＴＡＴ３、ＧＡＴＡ４及びＳＳＥＡ－３の、少なくとも１種、好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上を発現する。（ｄ）異種動物胚に細胞を移植すると作成されたキメラ胚の一部の組織・器官に発達する能力を有する。（ｅ）体外培養条件下で、少なくとも２胚葉由来、好ましくは３胚葉由来の細胞群を形成する。（ｆ）免疫不全マウスへの移植によって、テラトーマを形成しない傾向が強い。
前記（ａ）～（ｆ）の性質を有するか否かは、後述の公知の方法により確認可能である。
本発明の製造方法によれば、細胞の癌細胞化リスクを抑制することができる。そのため、本発明により癌細胞化が抑制された細胞は、再生医療用の材料細胞として、好適に用いることができる。更に、抗癌剤の新薬開発において重要な課題の一つであるヒストンの化学的修飾機構の解析に資することが可能である。更に、例えば損傷した軟骨再生のための基質細胞として、また美容液基材としての活用も期待できる。 (Method for reducing the risk of cancer cells)
The risk of cancer cell transformation can be reduced by the method for producing stem cells of the present invention.
Stem cells with reduced risk of canceration obtained by the method of reducing the risk of canceration of the present invention (a) have a normal diploid karyotype. (b) It is possible to subculture 30 times or more, preferably 40 times or more in an undifferentiated state. (c) having alkaline phosphatase activity and expressing at least one, preferably two or more, more preferably three or more of OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, STAT3, GATA4 and SSEA-3; (d) have the ability to develop into some tissues/organs of chimeric embryos produced by transplanting cells into heterologous animal embryos; (e) forming a population of cells from at least two germ layers, preferably from three germ layers under in vitro culture conditions; (f) There is a strong tendency not to form teratomas upon transplantation into immunodeficient mice.
Whether or not the material has the properties (a) to (f) can be confirmed by a known method described later.
According to the production method of the present invention, the risk of cells becoming cancer cells can be suppressed. Therefore, cells whose cancerous transformation has been suppressed by the present invention can be suitably used as material cells for regenerative medicine. Furthermore, it is possible to contribute to the analysis of the histone chemical modification mechanism, which is one of the important issues in the development of new anticancer agents. Furthermore, it can be expected to be used as matrix cells for regeneration of damaged cartilage, and as a base for beauty essences.

本発明の製造方法及び癌細胞化のリスク低減方法によれば、一般的ｉＰＳ細胞の作製法とは異なり、細胞への遺伝子導入処置を伴わないため、特別な施設を必要としない利点がある。また遺伝子導入処理を伴わないために、誘導した幹細胞における癌細胞化リスクが低減化され、安全な幹細胞を製造することが可能である。本発明による幹細胞は、ＳＴＡＴ３、及び／又はＧＡＴＡ４幹細胞マーカーを発現している。そこで事前に繊維芽細胞等からＳＴＡＴ３、ＧＡＴＡ４抗体陽性の細胞をＦＡＣＳ Ｓｏｒｔｅｒ等を用いて選別し、それら選別細胞を用いて本実施形態による幹細胞への誘導を行えば、より一層効率的な幹細胞を製造する方法となり得る。また、本発明によれば、癌細胞化のリスクが低減化された幹細胞株を樹立出来る為、所望の、種々の遺伝子の発現を抑制された幹細胞株や、その逆に、所望の遺伝子を導入することによる遺伝子導入された幹細胞株を製造することも可能である。 The production method and the method for reducing the risk of cancer cell transformation of the present invention have the advantage of not requiring special facilities because they do not involve gene transfer to cells, unlike general iPS cell production methods. In addition, since no gene introduction treatment is involved, the risk of cancer cell transformation in the induced stem cells is reduced, and safe stem cells can be produced. Stem cells according to the invention express STAT3 and/or GATA4 stem cell markers. Therefore, if STAT3 and GATA4 antibody-positive cells are sorted from fibroblasts or the like in advance using a FACS sorter or the like, and the sorted cells are used to induce stem cells according to the present embodiment, more efficient stem cells can be obtained. It can be a method of manufacturing. In addition, according to the present invention, stem cell lines with reduced risk of becoming cancer cells can be established. It is also possible to produce a transgenic stem cell line by doing.

《幹細胞の製造方法：実施態様２》
本発明の幹細胞の製造方法は、癌細胞のＪＤＰ２遺伝子をＲＮＡ干渉による抑制する工程を含む。 <<Method for Producing Stem Cells: Embodiment 2>>
The method for producing stem cells of the present invention includes a step of suppressing the JDP2 gene of cancer cells by RNA interference.

（癌細胞）
本発明の幹細胞の製造方法に用いる癌細胞は、動物の癌細胞である限りにおいて、特に限定されるものではなく、例えば膀胱癌細胞、乳癌細胞、大腸癌細胞、直腸癌細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞、肺癌細胞、小細胞肺癌細胞、食道癌細胞、胆嚢癌細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、胃癌細胞、子宮頸部癌細胞、甲状腺癌細胞、前立腺癌細胞、扁平上皮癌細胞、皮膚癌細胞、十二指腸癌細胞、腟癌細胞、又は脳腫瘍細胞が挙げられる。
また、癌細胞は各組織由来の癌細胞を、個人から採取し培養したものであってよく、既存の樹立された細胞株でもよい。癌細胞の細胞株は、例えば、理化学研究所細胞バンク等から入手してもよく、市販のものを用いてもよい。 (cancer cells)
Cancer cells used in the method for producing stem cells of the present invention are not particularly limited as long as they are animal cancer cells. liver cancer cells, lung cancer cells, small cell lung cancer cells, esophageal cancer cells, gallbladder cancer cells, ovarian cancer cells, pancreatic cancer cells, gastric cancer cells, cervical cancer cells, thyroid cancer cells, prostate cancer cells, squamous cell cancer cells, Skin cancer cells, duodenal cancer cells, vaginal cancer cells, or brain tumor cells.
In addition, cancer cells may be those obtained by collecting and culturing cancer cells derived from each tissue from an individual, or may be existing established cell lines. Cell lines of cancer cells may be obtained, for example, from the RIKEN Cell Bank or the like, or commercially available ones may be used.

癌細胞が由来する動物は、特に限定されず、例えばヒト又はヒト以外の動物（例えば、哺乳類）が挙げられる。ヒト以外の動物としては、例えばマウス若しくはラットなどの齧歯類、ウシ若しくはヒツジなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、イヌ若しくはネコなどの食肉類等、又はサル若しくはチンパンジーなどの霊長類；等の任意の哺乳類が挙げられるが、好ましくはヒト又はヒト以外の霊長類である。 Animals from which cancer cells are derived are not particularly limited, and include, for example, humans and non-human animals (eg, mammals). Non-human animals include, for example, rodents such as mice or rats, artiodactyls such as cows or sheep, peri-hoofed animals such as horses, carnivores such as dogs or cats, or primates such as monkeys or chimpanzees; etc., preferably humans or non-human primates.

（ＪＤＰ２遺伝子）
本発明の幹細胞の製造方法によって、干渉される癌細胞のＪＤＰ２遺伝子は、ｃ－Ｊｕｎ遺伝子のファミリー遺伝子であり、ＪＤＰ２タンパク質をコードする核酸である。ＪＤＰ２遺伝子から転写されるｍＲＮＡから翻訳されるＪＤＰ２タンパク質の合成を抑制することによって、癌細胞から幹細胞を誘導することができる。
干渉されるＪＤＰ２遺伝子は動物によって異なる。ＪＤＰ２遺伝子及び蛋白質配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから得ることができる。例えば、ヒトのＪＤＰ２遺伝子のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＮＭ－００１１３５０４７．１として登録されている。ヒトのＪＤＰ２遺伝子配列を配列番号１に示す。それぞれの動物のＪＤＰ２遺伝子の発現が、ＲＮＡ干渉によって抑制され、癌細胞から幹細胞が誘導される。 (JDP2 gene)
The JDP2 gene of cancer cells that is interfered with by the method for producing stem cells of the present invention is a gene of the c-Jun gene family and is a nucleic acid that encodes the JDP2 protein. Stem cells can be induced from cancer cells by suppressing the synthesis of the JDP2 protein translated from the mRNA transcribed from the JDP2 gene.
The JDP2 gene that is interfered with varies from animal to animal. JDP2 gene and protein sequence information can be obtained from publicly known databases such as GenBank. For example, the nucleotide sequence of the human JDP2 gene is deposited in GenBank under accession number NM-001135047.1. The human JDP2 gene sequence is shown in SEQ ID NO:1. Expression of the JDP2 gene in each animal is suppressed by RNA interference, and stem cells are induced from cancer cells.

（ＲＮＡ干渉）
本発明の幹細胞の製造方法におけるＲＮＡ干渉は、癌細胞から幹細胞を製造できる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスヌクレオチド、又はアプタマー（以下、これらを纏めて「ＲＮＡ干渉用分子」と称することがある）を含む。
これらのＲＮＡ干渉用分子により、ＪＤＰ２遺伝子の発現が抑制される。抑制されるＪＤＰ２遺伝子は、前記の通り動物ごとに異なっている。従って、ＲＮＡ干渉用分子は、それぞれの動物由来のＪＤＰ２遺伝子の配列に従って、設計されることが好ましい。すなわち、癌細胞がヒト由来である場合、ヒトのＪＤＰ２遺伝子のＲＮＡ配列から設計されることが好ましい。用いるＲＮＡ干渉用分子は、１種類でもよいが、２種類以上、又は３種類以上のＲＮＡ干渉用分子を混合して用いることによって、幹細胞の製造の効率を向上させることができる。 (RNA interference)
RNA interference in the method for producing stem cells of the present invention is not particularly limited as long as stem cells can be produced from cancer cells. It includes RNA (miRNA), antisense nucleotides, or aptamers (hereinafter collectively referred to as "RNA interference molecules").
These RNA interference molecules suppress the expression of the JDP2 gene. The repressed JDP2 gene differs from animal to animal, as described above. Therefore, RNA interference molecules are preferably designed according to the sequence of the JDP2 gene derived from each animal. That is, when cancer cells are of human origin, they are preferably designed from the RNA sequence of the human JDP2 gene. Although one type of RNA interference molecule may be used, the efficiency of stem cell production can be improved by using a mixture of two or more types of RNA interference molecules, or three or more types of RNA interference molecules.

（ＲＮＡ干渉用分子の癌細胞への導入）
ＲＮＡ干渉用分子の癌細胞への導入は、公知のトランスフェクションによって実施することができる。例えば、トランスフェクション試薬によって導入してもよく、エレクトロポレーションによって導入してもよい。トランスフェクション試薬としては、例えばLipofectamineを用いることができる。 (Introduction of RNA interference molecule into cancer cells)
Introduction of RNA interference molecules into cancer cells can be performed by known transfection methods. For example, it may be introduced by a transfection reagent or by electroporation. Lipofectamine, for example, can be used as a transfection reagent.

（ＲＮＡ干渉分子用ベクター）
ＲＮＡ干渉分子用ベクター（例えば、相補的低分子ＲＮＡベクター）は、ＲＮＡの核酸配列を決定すれば、本発明の属する技術分野で公知の方法によって調製することができる。得られたＲＮＡ干渉分子用ベクターを癌細胞内に導入することによって、癌細胞内で、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスヌクレオチド、又はアプタマーなどを発現させ、ＪＤＰ２遺伝子の発現を抑制することができる。 (Vector for RNA interference molecule)
Vectors for RNA interference molecules (eg, complementary small RNA vectors) can be prepared by methods known in the technical field to which the present invention belongs, once the nucleic acid sequence of the RNA is determined. By introducing the obtained RNA interference molecule vector into cancer cells, small interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), microRNA (miRNA), antisense nucleotide, Alternatively, an aptamer or the like can be expressed to suppress the expression of the JDP2 gene.

（エレクトロポレーション）
以下に、ＲＮＡ干渉用分子の癌細胞への導入方法の１つであるエレクトロポレーションについて説明するが、導入方法はエレクトロポレーションに限定されるものではない。
エレクトロポレーションにより、ＲＮＡ干渉用分子を細胞に導入するが、同時に癌細胞に電気刺激を付与することができる。電気刺激を与えることにより、効率的に幹細胞を製造することができる。エレクトロポレーション装置は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子導入用に市販されているものを用いてもよく、自ら製作したものを用いてもよい。その規格は特に限定されないが、例えば短矩パルス方式で１ボルト刻みの電圧設定が可能なものが好ましい。また、エレクトロポレーション装置は、パルス幅、パルス間隔、パルス回数を、それぞれ０．１～９９９ミリ秒、０．１～９９９ミリ秒、１～９９回に設定可能なものが好ましい。 (electroporation)
Electroporation, which is one method for introducing RNA interference molecules into cancer cells, will be described below, but the introduction method is not limited to electroporation.
Electroporation introduces molecules for RNA interference into cells, while simultaneously providing electrical stimulation to cancer cells. Stem cells can be efficiently produced by applying electrical stimulation. As an electroporation apparatus, for example, a commercially available one for in vitro gene transfer may be used, or an apparatus manufactured by oneself may be used. Although the standard is not particularly limited, for example, a short rectangular pulse system capable of setting the voltage in increments of 1 volt is preferable. Further, the electroporation apparatus preferably has a pulse width, a pulse interval, and a pulse frequency that can be set to 0.1 to 999 milliseconds, 0.1 to 999 milliseconds, and 1 to 99 times, respectively.

本発明の製造方法においては、癌細胞に電気刺激を与えることにより、癌細胞における細胞骨格形成が一時的に阻害され、細胞初期化を誘導すると考えられる。以下に具体的なエレクトロポレーションの操作を記載する。 In the production method of the present invention, the application of electrical stimulation to cancer cells is thought to temporarily inhibit cytoskeleton formation in cancer cells and induce cell reprogramming. A specific electroporation operation is described below.

例えば、癌細胞を１～５×１０^５細胞／ｍＬ濃度で、電気刺激用溶液２００～４００μＬに分散し、ＲＮＡ干渉用分子（例えば、ＪＤＰ２遺伝子ＲＮＡ干渉ベクター）を含む溶液（例えば、１μｇ／μＬ濃度）を５～２０μＬ添加した後、キュベット電極容器に移し替える。キュベット電極容器をエレクトロポレーション装置に接続し、パルス幅０．１～１００ミリ秒、パルス間隔１～１００ミリ秒、パルス回数１～２０回で、１～２００ボルトの電圧を印加する。また、前記の電気刺激処置は、１回に限定されず、例えば２～５回程度、好ましくは３回程度繰り返してもよい。電気刺激処置を繰り返す場合、電気刺激処置間の間隔としては、例えば、１～１５分間隔が挙げられ、５～１０分間が好ましい。 For example, cancer cells are dispersed at a concentration of 1 to 5×10 ⁵ cells/mL in 200 to 400 μL of an electrical stimulation solution, and a solution (eg, 1 μg/μL) containing an RNA interference molecule (eg, JDP2 gene RNA interference vector) is used. concentration), and then transferred to a cuvette electrode container. The cuvette electrode container is connected to an electroporation apparatus, and a voltage of 1 to 200 volts is applied with a pulse width of 0.1 to 100 ms, a pulse interval of 1 to 100 ms, and a pulse frequency of 1 to 20 times. Moreover, the above electrical stimulation treatment is not limited to one time, and may be repeated, for example, about 2 to 5 times, preferably about 3 times. When the electrical stimulation treatment is repeated, the interval between electrical stimulation treatments may be, for example, 1 to 15 minute intervals, preferably 5 to 10 minutes.

ＪＤＰ２遺伝子のＲＮＡ干渉、及び細胞幹細胞誘導のための電気刺激処置の具体例としては、後述の実施例で用いられたもの等が挙げられる。例えば細胞分散液とＪＤＰ２遺伝子ＲＮＡ干渉ベクター溶液の入ったキュベット電極容器をエレクトロポレーション装置に接続し、直流電流を電圧２０ボルト、パルス幅５０ミリ秒、パルス間隔５０ミリ秒、パルス回数１０回の設定で、キュベット電極に印加する。その後、１０～１５分間隔で３～５回、同様の電気刺激を反復することが例示される。このよう処理により癌細胞の幹細胞化及び後述の癌細胞化のリスクの低減を同時に行うことができる。 Specific examples of the electrical stimulation treatment for RNA interference of the JDP2 gene and induction of cell stem cells include those used in Examples described later. For example, a cuvette electrode container containing a cell dispersion and a JDP2 gene RNA interference vector solution is connected to an electroporation device, and a direct current is applied at a voltage of 20 volts, a pulse width of 50 ms, a pulse interval of 50 ms, and a pulse number of 10 times. Apply to the cuvette electrodes at the setting. After that, repeating the same electrical stimulation three to five times at intervals of 10 to 15 minutes is exemplified. By such treatment, it is possible to simultaneously convert cancer cells into stem cells and reduce the risk of cancer cell formation, which will be described later.

前記エレクトロポレーションにより、癌細胞にＲＮＡ干渉及び幹細胞誘導の電気刺激を与えた後は、通常用いられる幹細胞の培養条件等を用いて、癌細胞を培養すればよい。これにより、癌細胞由来幹細胞を得ることができる。 After applying electrical stimulation for RNA interference and stem cell induction to the cancer cells by the electroporation, the cancer cells may be cultured under commonly used culture conditions for stem cells. Thereby, cancer cell-derived stem cells can be obtained.

培養に用いる培地は、幹細胞の培養に用いられているものを、限定せずに使用することができるが、例えばＤＭＥＭ培地、又はＭＥＭ－α培地を用いることができる。更に、牛胎児血清（ＦＣＳまたはＦＢＳ）、牛新生児血清（ＮＢＣＳ）、ヒト血清、血清代替物、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、骨形成蛋白因子４（ＢＭＰ４）、及びインスリン成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）からなる群より選択される少なくとも１種を含んでもよい。すなわち、ＭＥＭ－α培地又はＤＭＥＭ培地等の公知の培地に、前記成分を添加した培地を好適に用いることができる。培地中の前記各成分の濃度は、幹細胞の培養に通常用いられる濃度とすればよく、例えばＦＣＳ、ＦＢＳ、ＮＢＣＳ、ヒト血清、血清代替物の濃度としては５～１０％（Ｖ／Ｖ）、ＬＩＦ、ＢＭＰ４、ＩＧＦＢＰ３の濃度としては５～２０ｎｇ／ｍＬが挙げられる。
培養期間は、幹細胞が製造できる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば、３～３０日であり、好ましくは７～２０日であり、更に好ましくは１０～１４日である。細胞の増殖に応じて２～６日おきに、適宜、継代、又は培地交換を行ってもよい。
培養温度も、特に限定されるものではないが、例えば３５～３８℃であり、好ましくは３６．５～３７．５℃であり、より好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ_２濃度条件としては、例えば４～６％であり、好ましくは約５％である。 The culture medium used for culturing is not limited to that used for culturing stem cells, and for example, DMEM medium or MEM-α medium can be used. In addition, fetal bovine serum (FCS or FBS), neonatal bovine serum (NBCS), human serum, serum substitutes, leukemia inhibitory factor (LIF), bone morphogenetic protein factor 4 (BMP4), and insulin growth factor binding protein 3 (IGFBP3) ) may include at least one selected from the group consisting of That is, a known medium such as MEM-α medium or DMEM medium supplemented with the above components can be suitably used. The concentration of each component in the medium may be the concentration normally used for culturing stem cells. Concentrations of LIF, BMP4, and IGFBP3 include 5-20 ng/mL.
The culture period is not particularly limited as long as stem cells can be produced, but is, for example, 3 to 30 days, preferably 7 to 20 days, more preferably 10 to 14 days. Depending on the growth of the cells, passage or medium exchange may be performed every 2 to 6 days as appropriate.
The culture temperature is also not particularly limited, but is, for example, 35 to 38°C, preferably 36.5 to 37.5°C, more preferably about 37°C. Also, the CO ₂ concentration condition is, for example, 4 to 6%, preferably about 5%.

電気刺激後の癌細胞の培養方法の具体例を以下に記載するが、この培養方法に限定されるものではない。細胞に電気刺激を与えた後、細胞をキュベット電極容器等から取り出し、適切な培養容器（例えば、プラスチック径３．５ｃｍ皿等）に入れた幹細胞用培地等に播種し、前記のような培養条件下で培養する。電気刺激後に前記のような培養を行うことにより、細胞はＥＳ細胞様の細胞コロニーを形成する。
適時培地交換を行い（例えば１～２日に１度）、ＥＳ細胞様の小コロニー（細胞数１０程度）が出現するまで培養を継続する。ＥＳ細胞様細胞コロニーが複数（例えば５以上）出現した時点で、トリプシン処理により細胞を培養皿から剥離させ、遠心分離により細胞を回収する。回収した細胞は、幹細胞培養用培地等で再培養を行う。この再培養を３～４回繰返すことにより、特徴的なＥＳ細胞様細胞コロニーの集団が多数出現するようになる。前記ＥＳ細胞様細胞コロニーを形成する細胞は、幹細胞の特徴を有し、多分化能を有する幹細胞である。
電気刺激後の細胞の培養方法は、前記方法に限定されず、遺伝子導入後のｉＰＳ細胞の培養に用いられる方法等を特に制限なく用いることができる。例えば、培養には、幹細胞の培養に一般的に用いられるフィーダー細胞を用いてもよい。フィーダー細胞としては、例えば、マウス胎児繊維芽細胞（例えばＭＥＦ細胞、ＳＴＯ細胞、又はＳＮＬ細胞など）等が挙げられる。但し、電気刺激後の細胞は、約１～２日に１度培地の交換を行いながらコンフルエントになるまで培養を行うことにより、フィーダー細胞のサポートを必要とせずに、細胞死を招くことなく継代培養を続けることができる。 A specific example of a method for culturing cancer cells after electrical stimulation is described below, but the method is not limited to this culturing method. After the cells are electrically stimulated, the cells are removed from the cuvette electrode container or the like, seeded in a stem cell medium or the like placed in an appropriate culture vessel (for example, a plastic dish with a diameter of 3.5 cm), and cultured under the above conditions. cultured below. By culturing as described above after electrical stimulation, the cells form ES cell-like cell colonies.
The medium is changed at appropriate times (for example, once every 1 to 2 days), and culture is continued until ES cell-like small colonies (about 10 cells) appear. When a plurality (for example, 5 or more) of ES cell-like cell colonies appear, the cells are detached from the culture dish by trypsinization and collected by centrifugation. The collected cells are re-cultured in a stem cell culture medium or the like. By repeating this reculturing 3 to 4 times, a large number of characteristic ES cell-like cell colony populations emerge. The cells forming the ES cell-like cell colony are stem cells having stem cell characteristics and pluripotency.
The method for culturing cells after electrical stimulation is not limited to the methods described above, and methods used for culturing iPS cells after gene transfer can be used without particular limitations. For example, feeder cells generally used for culturing stem cells may be used for culturing. Examples of feeder cells include embryonic mouse fibroblasts (eg, MEF cells, STO cells, SNL cells, etc.) and the like. However, after electrical stimulation, the cells are cultured until they become confluent while changing the medium once every 1-2 days. Subculture can be continued.

（幹細胞マーカー）
本発明の製造方法で得られた幹細胞は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＳＴＡＴ３、及びＧＡＴＡ４からなる群から選択される少なくとも１つの幹細胞マーカーを発現する。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＳＴＡＴ３、及びＧＡＴＡ４は前記「《幹細胞の製造方法：実施態様１》」の項で説明したものと同じである。 (stem cell marker)
Stem cells obtained by the production method of the present invention express at least one stem cell marker selected from the group consisting of OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, STAT3, and GATA4. OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, STAT3, and GATA4 are the same as those described in the section "<Method for Producing Stem Cells: Embodiment 1>".

（癌幹細胞の細胞化学的特徴）
本発明の幹細胞の製造方法によって、得られた幹細胞の細胞化学的特徴を説明する。
前記幹細胞は、（ａ）未分化状態で３０回以上、好ましくは４０回以上の継代が可能である。（ｂ）アルカリフォスファターゼ活性を有し、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＳＴＡＴ３、ＧＡＴＡ４及びＳＳＥＡ－３の少なくとも１種、好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上を発現する。（ｃ）免疫不全マウスへの移植によりテラトーマを形成し、当該テラトーマ内に少なくとも２胚葉、好ましくは３胚葉を形成する。（ｄ）体外培養条件下で、少なくとも２胚葉由来、好ましくは３胚葉由来の細胞群を形成する。前記（ｂ）は、細胞が未分化状態であることを示し、前記（ｃ）及び（ｄ）は、細胞が多分化能を有することを示す。前記（ａ）～（ｄ）の性質を有するか否かは、公知の方法により確認可能である。 (Cytochemical characteristics of cancer stem cells)
The cytochemical characteristics of stem cells obtained by the method for producing stem cells of the present invention will be described.
The stem cells (a) can be passaged 30 times or more, preferably 40 times or more in an undifferentiated state. (b) having alkaline phosphatase activity and expressing at least one, preferably two or more, more preferably three or more of OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, STAT3, GATA4 and SSEA-3; (c) forming a teratoma by transplantation into an immunodeficient mouse and forming at least two germ layers, preferably three germ layers within the teratoma; (d) forming a population of cells from at least two germ layers, preferably from three germ layers under in vitro culture conditions; The above (b) indicates that the cells are in an undifferentiated state, and the above (c) and (d) indicate that the cells have pluripotency. Whether or not the material has the properties (a) to (d) can be confirmed by a known method.

例えば、前記（ｂ）については、特開２００２－１７６９７３号公報に記載の方法、Wang S W, et al., Cell Death & Disease 4, e907 (2013)に記載の方法を用いて確認することができる。 For example, the above (b) can be confirmed using the method described in JP-A-2002-176973 and the method described in Wang S W, et al., Cell Death & Disease 4, e907 (2013). .

また、前記（ｃ）については、例えば、以下の様に実施することができる。例えば１０％牛血清代替物含有の培地（例、ＤＭＥＭ培地等）中に、例えば１×１０^６個細胞／ｍＬの濃度で細胞を分散させ、免疫不全マウスの側腹皮下に前記細胞分散液を数ｍＬ注入する（例、１ｍＬ）。約１ヶ月後、形成されたテラトーマを摘出し、組織学的解析により、テラトーマ内に三胚葉が形成されているか否かを確認する。 Moreover, the above (c) can be carried out, for example, as follows. For example, cells are dispersed in a medium containing 10% bovine serum substitute (eg, DMEM medium, etc.) at a concentration of, for example, 1×10 ⁶ cells/mL, and the cell dispersion is subcutaneously applied to the flank of an immunodeficient mouse. Inject several mL (eg, 1 mL). After about one month, the formed teratoma is excised, and histological analysis is performed to confirm whether or not three germ layers are formed within the teratoma.

また、前記（ａ）については、３０代以上継代を行い、継代細胞が前記（ｂ）の性質を維持しているかどうかを確認すればよい。本実施形態の製造方法により製造された幹細胞は、通常３０代以上（好ましくは４０代以上）の継代が可能である。なお、本明細書において、「継代」とは、細胞がほぼコンフルエントな状態に達した時点で、細胞の一部（例えば１／３～１／５）を、別の培養容器に入った同様の培地に移し替え、再びコンフルエントな状態まで細胞を増殖させることを意味する。本明細書においては、前記一連の操作を継代数として１回と規定する。なお、通常１回の継代で、細胞は３～６回の細胞分裂を行い得る。 As for the above (a), it may be confirmed whether or not the subcultured cells maintain the properties of the above (b) by subculturing for 30 or more generations. Stem cells produced by the production method of the present embodiment can usually be subcultured for 30 or more generations (preferably 40 or more generations). As used herein, the term "passage" means that a portion of the cells (eg, 1/3 to 1/5) is transferred to another culture vessel when the cells reach a nearly confluent state. medium, and grow the cells again to a confluent state. In the present specification, the series of operations is defined as one passage number. In general, cells can undergo 3 to 6 cell divisions in one passage.

本実施形態の製造方法により製造される癌細胞由来幹細胞は、多分化能を有するため、様々な細胞初期化を誘導する、組織に分化誘導させることが出来る。分化細胞は再生医療用材料として、用いることができる。また癌細胞の悪性化と初期化メカニズムの分子医学、発生学上の解析に有用な研究材料を提供し得る。更に、ＪＤＰ２の発現抑制剤を開発し、抗癌剤として臨床に応用出来る可能性がある。 Since the cancer cell-derived stem cells produced by the production method of the present embodiment have pluripotency, they can be induced to differentiate into tissues by inducing various cell reprogramming. Differentiated cells can be used as materials for regenerative medicine. It can also provide useful research materials for molecular medicine and developmental analysis of malignant transformation and reprogramming mechanisms of cancer cells. Furthermore, it may be possible to develop a JDP2 expression inhibitor and apply it clinically as an anticancer agent.

《幹細胞》
本発明の幹細胞は、本発明の実施態様１又は実施態様２の幹細胞の製造方法によって得ることができる。前記幹細胞は、癌細胞化のリスクが低減されており、従来の幹細胞とは異なる性質を有していると考えられる。また、従来の幹細胞とは細胞科学的特徴も異なっていると考えられる。 《Stem cells》
The stem cells of the present invention can be obtained by the method for producing stem cells according to Embodiment 1 or Embodiment 2 of the present invention. The stem cells have a reduced risk of becoming cancer cells, and are considered to have different properties from conventional stem cells. In addition, it is considered that the cytochemical characteristics are also different from conventional stem cells.

《作用》
本発明において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤によって、幹細胞が製造されるメカニズムは、明確に解析されたわけではないが、以下のように推定することができる。
ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の阻害剤は、体細胞の初期化を誘導するものと推定される。更に、得られた幹細胞に抗癌性を付与しているものと考えられる。
また、本発明において、癌細胞のＪＤＰ２遺伝子を抑制することによって、幹細胞が製造されるメカニズムは、明確に解析されたわけではないが、以下のように推定することができる。
発癌遺伝子ｃ－Ｊｕｎが、細胞の初期化に関与しており、特にＪＤＰ２遺伝子が細胞の初期化に関与し、その発現を抑制することにより、細胞を幹細胞に誘導できたものと推定される。 《Action》
In the present invention, the mechanism by which stem cells are produced by a histone deacetylase inhibitor has not been clearly analyzed, but can be presumed as follows.
Inhibitors of histone deacetylase (HDAC) are presumed to induce somatic cell reprogramming. Furthermore, it is considered that the resulting stem cells are endowed with anticancer properties.
In addition, in the present invention, the mechanism by which stem cells are produced by suppressing the JDP2 gene of cancer cells has not been clearly analyzed, but can be presumed as follows.
It is presumed that the oncogene c-Jun is involved in cell reprogramming, and the JDP2 gene in particular is involved in cell reprogramming, and suppressing its expression could induce the cells to become stem cells.

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to Examples, but these are not intended to limit the scope of the present invention.

《実施例１》ヒト肝癌株細胞ＨｅｐＧ２へのＪＤＰ２ＲＮＡ干渉による幹細胞への誘導の確認
凍結保存中のヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２（理研細胞銀行より入手）を融解後、１０％ＦＣＳ（Gibco, Life Technologies）と抗生物質（Gibco, Life Technologies）とを加えたＭＥＭα培地（Gibco, Life Technologies）を５．０ｍＬ入れた径１０ｃｍ皿（Greiner Bio-One）上で、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で増殖培養を行い、実験に用いる材料とした。
培養開始後４～５日経過して、コンフルエントに達した時点で、０．２５％トリプシン液（Gibco, Life Technologies）で７～８分間処理し、遠心後、約５×１０^５細胞／ｍＬの濃度で、合成を依頼したＪＤＰ２のＲＮＡ干渉用ベクター３種（Santa Cruz Biotechnology）を含む溶液（１μｇ／ｍＬ）を２０μＬ加えたＤＭＥＭ液２００μＬ中で分散し、混和させた。その後、前記混和液をキュベット電極容器に移し替えた。なお、ＪＤＰ２干渉用のＲＮＡ配列（Ａ、Ｂ及びＣ）はそれぞれ以下の通りである。
Ａ．
・センス：ＧＧＡＵＧＧＡＡＣＵＣＡＧＡＡＵＧＡＡｔｔ（配列番号２）
・アンチセンス：ＵＵＣＡＵＵＣＵＧＡＧＵＵＣＣＡＵＣＣｔｔ（配列番号３）
Ｂ．
・センス：ＧＡＵＧＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＡｔｔ（配列番号４）
・アンチセンス：ＵＵＣＵＵＣＵＵＧＵＵＣＣＧＧＣＡＵＣｔｔ（配列番号５）
Ｃ．
・センス：ＧＣＵＵＵＣＡＡＣＵＧＣＡＣＡＵＧＵＵｔｔ（配列番号６）
・アンチセンス：ＡＡＣＡＵＧＵＧＣＡＧＵＵＧＡＡＡＧＣｔｔ（配列番号７） <<Example 1>> Confirmation of induction of stem cells by JDP2 RNA interference into human liver cancer cell line HepG2 After thawing human liver cancer cell line HepG2 (obtained from Riken Cell Bank) during cryopreservation, 10% FCS (Gibco, Life Technologies) was used. and antibiotics (Gibco, Life Technologies) on a 10 cm diameter dish (Greiner Bio-One) containing 5.0 mL of MEMα medium (Gibco, Life Technologies) under conditions of 37° C., 5% CO ₂ Proliferation culture was performed and used as materials for experiments.
After 4 to 5 days from the start of the culture, when it reached confluency, it was treated with 0.25% trypsin solution (Gibco, Life Technologies) for 7 to 8 minutes, centrifuged, and then about 5 × 10 ⁵ cells/mL. 20 μL of a solution (1 μg/mL) containing three types of JDP2 RNA interference vectors (Santa Cruz Biotechnology) whose synthesis was requested at the same concentration was dispersed and mixed in 200 μL of DMEM solution. After that, the mixed liquid was transferred to the cuvette electrode container. The RNA sequences (A, B and C) for JDP2 interference are as follows.
A.
・Sense: GGAUGGAACUCAGAAUGAAtt (SEQ ID NO: 2)
- Antisense: UUCAUUCUGAGUUCCAUCCtt (SEQ ID NO: 3)
B.
・Sense: GAUGCCGGAACAAGAAGAAtt (SEQ ID NO: 4)
- Antisense: UUCUUCUUGUUCCGGCAUCtt (SEQ ID NO: 5)
C.
- Sense: GCUUUCAACUGCACAUGUUtt (SEQ ID NO: 6)
- Antisense: AACAUGUGCAGUUGAAAGCtt (SEQ ID NO: 7)

前記混和液の入ったキュベット電極をエレクトロポレーション装置（ＣＵＹ２１、Ｂｅｘ）に接続し、２０ボルト電圧、５０ミリ秒パルス幅、５０ミリ秒パルス間隔、１０回パルス回数の設定でパルス電流を発生させた。その後、細胞を同一のキュベット電極に入れたまま、１０分間の間隔で３回、同様設定で電気刺激処置を反復した。１０％ＦＣＳと抗生物質を含有し、更に１０ｎｇ／ｍＬ－ＬＩＦ（Sigma）、１０μｇ／ｍＬ－ＢＭＰ４（Sigma）、及び１０μｇ／ｍＬ－ＩＧＦＢＰ３（Sigma）を加えたＭＥＭα培地を、フィーダー細胞の被覆の無い、３．５ｃｍ径皿（Iwaki）に１．５ｍＬ入れ、当該皿上で前記刺激処置後の細胞を播種後、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養を開始した。 The cuvette electrode containing the admixture was connected to an electroporation device (CUY21, Bex), and a pulse current was generated at a voltage of 20 volts, a pulse width of 50 milliseconds, a pulse interval of 50 milliseconds, and a pulse number of 10 times. rice field. The electrical stimulation treatment was then repeated with the same settings three times at 10 minute intervals while the cells were still in the same cuvette electrode. MEMα medium containing 10% FCS and antibiotics and further supplemented with 10 ng/mL-LIF (Sigma), 10 μg/mL-BMP4 (Sigma), and 10 μg/mL-IGFBP3 (Sigma) was used to coat the feeder cells. 1.5 mL was placed in a 3.5 cm diameter dish (Iwaki), and after seeding the cells after the stimulation treatment on the dish, culturing was started under conditions of 37° C. and 5% CO ₂ .

１日１回培地交換を行いながら培養を継続すると、培養開始後７～１０日程で、培養皿上に、細胞数１０～２０程度のコロニーが多数出現した（全体の数パーセント）。皿中の大多数は、ＨｅｐＧ２細胞特有の上皮様形態細胞であるが、細胞コロニーを形成する細胞の増殖性はそれらを上回っている為、継代培養を３～４回繰返すことにより、電気刺激処置後約１４日間でコロニーを形成する細胞が優勢となった。これらのコロニーは、幹細胞特有の形態、つまり細胞同士が密着して集まり、細胞の殆どの面積を細胞核が占有し、細胞質の割合が極端に少ない、典型的なＥＳ様細胞の形態を示す幹細胞様コロニーであった。前記幹細胞様コロニーの顕微鏡写真を図１に示す。 When the culture was continued while exchanging the medium once a day, many colonies with about 10 to 20 cells appeared on the culture plate 7 to 10 days after the start of the culture (several percent of the total). The majority of the cells in the dish are epithelial-like cells peculiar to HepG2 cells. Colony-forming cells predominated approximately 14 days after treatment. These colonies had a morphology peculiar to stem cells, i.e. stem cell-like cells showing a typical ES-like cell morphology, in which the cells were tightly packed together, the nucleus occupied most of the cell area, and the proportion of cytoplasm was extremely low. was a colony. A photomicrograph of the stem cell-like colony is shown in FIG.

上記の様に樹立したＨｅｐＧ２細胞由来幹細胞様細胞に関して、幹細胞として必須の多能性並びに未分化性の有無を、継代数２０の細胞を用いて、細胞免疫学かつ分子生物学的解析により解析した。具体的には前記幹細胞様細胞は、幹細胞マーカーであるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＳＴＡＴ３、及びＧＡＴＡ４の各抗体に対し陽性反応を示した（図２）。 With respect to the HepG2 cell-derived stem cell-like cells established as described above, the presence or absence of pluripotency and undifferentiation essential for stem cells was analyzed by cell immunological and molecular biological analysis using cells at passage number 20. . Specifically, the stem cell-like cells showed positive reactions to antibodies against stem cell markers OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, STAT3, and GATA4 (Fig. 2).

更に、多能性の証明として、継代数２０の細胞を免疫不全マウスの生体内に移植し、テラトーマ内に三胚葉由来組織学的解析を形成する能力の確認を行った。ＨｅｐＧ２由来幹細胞によるテラトーマの形成を調べた。即ち、免疫不全ＳＣＩＤマウスの側腹皮下組織に、約１×１０^７個ずつの細胞を１ｍＬの１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に拡散させて注入した。なお、継代数の違いで２区分として、グループ１及び２の２区分けとした。 Furthermore, as proof of pluripotency, cells at passage 20 were implanted in vivo into immunodeficient mice to confirm their ability to form trigerm-layer-derived histological analyzes within teratomas. Teratoma formation by HepG2-derived stem cells was examined. Briefly, about 1×10 ⁷ cells were dispersed in 1 mL of DMEM medium containing 10% FCS and injected into the flank subcutaneous tissue of immunodeficient SCID mice. In addition, it was divided into groups 1 and 2, which were divided into two groups due to the difference in the number of passages.

表中の値は各グループ２頭ずつに形成されたテラトーマの大きさの平均値を示す。

The values in the table indicate the average size of teratomas formed in two animals in each group.

各グループ２頭ずつとして、合計４頭のＳＣＩＤマウスにＨｅｐＧ２由来ＪＤＰ２ＲＮＡ干渉幹細胞様細胞の移植を行った。移植後３０日でテラトーマを摘出し、テラトーマの組織検査を行った。グループ（１）のテラトーマ標本には、外胚葉由来としてケラチノサイト、中胚葉由来として血管内皮様組織、内胚葉由来として消化管組織の形成が認められ、グループ（１）の細胞の多能性が確認された（図３）。また、グループ１及び２共に、テラトーマの形成が確認された（図４）。 HepG2-derived JDP2 RNA interference stem cell-like cells were transplanted into a total of 4 SCID mice, 2 mice per group. Thirty days after the transplantation, the teratoma was removed and histological examination of the teratoma was performed. In the teratoma specimen of group (1), the formation of keratinocytes derived from ectoderm, vascular endothelial-like tissue derived from mesoderm, and gastrointestinal tissue derived from endoderm was observed, confirming the pluripotency of cells of group (1). (Fig. 3). In both Groups 1 and 2, formation of teratoma was confirmed (Fig. 4).

《実施例２》ヒト繊維芽細胞のヒドロキサム酸添加培養による幹細胞への誘導及び癌細胞化リスクの低減性の確認
凍結保存中のヒト繊維芽細胞ＮＨＤＦ（クラボウより購入）を融解後、実施１の場合と同様、１０％ＦＣＳ（Gibco）と抗生物質―抗菌剤（Gibco）とを加えたＭＥＭα（Gibco）を５．０ｍＬ入れた径１０ｃｍ培養皿（Greiner）上で、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養し、実験に用いる細胞材料とした。
培養開始後６～７日経過し、コンフルエントに達した時点でトリプシン処理を行い、遠心分離にて細胞を回収した。細胞を接着させず、浮遊培養を行うためポリＨＥＭＡ（Ｓｉｇｍａ）６００ｍｇをエチルアルコール４０ｍＬ中で溶解させ、８００μＬ宛径３．５ｃｍの培養皿（Nunc, Thermo Scientific）に塗布し、一晩乾燥させた。スベロイルビスヒドロキサム酸（Cosmo Bio）を１００μｇ／ｍＬ濃度で含有させた、実施例１の幹細胞樹立用培地、つまり１０％ＦＣＳ、抗生物質を含有し、更に１０ｎｇ／ｍＬ－ＬＩＦ（Sigma）、及び１０ｎｇ／ｍＬ－ＢＭＰ４（Sigma）、及び１０ｎｇ／ｍＬ－ＩＧＦＢＰ３（Sigma）を加えたＭＥＭα培地に上記の回収されたＮＨＤＦ細胞を、約５×１０^５個細胞／ｍＬの濃度で、２ｍＬの培地に分散させた後、ポリＨＥＭＡ塗布培養皿に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養を開始した。 <<Example 2>> Confirmation of induction of stem cells by hydroxamic acid-added culture of human fibroblasts and reduction of risk of cancer cell formation As in the case, on 10 cm diameter culture dishes (Greiner) containing 5.0 mL of MEMα (Gibco) with 10% FCS (Gibco) and antibiotic-antimicrobial (Gibco) at 37° C., 5% CO _{2 .} were cultured under the conditions of , and used as cell materials for experiments.
After 6 to 7 days from the start of the culture, when the cells reached confluency, trypsinization was performed and the cells were collected by centrifugation. In order to perform suspension culture without adhering cells, 600 mg of polyHEMA (Sigma) was dissolved in 40 mL of ethyl alcohol, 800 μL was applied to a 3.5 cm diameter culture dish (Nunc, Thermo Scientific), and dried overnight. . Stem cell establishment medium of Example 1 containing suberoyl bishydroxamic acid (Cosmo Bio) at a concentration of 100 μg / mL, that is, 10% FCS, containing antibiotics, further 10 ng / mL-LIF (Sigma), and 10 ng/mL-BMP4 (Sigma) and 10 ng/mL-IGFBP3 (Sigma) were added to MEMα medium, and the collected NHDF cells were added to 2 mL of medium at a concentration of about 5 × 10 ⁵ cells/mL. After being dispersed, they were seeded on a polyHEMA-coated culture dish, and culture was started under conditions of 37° C. and 5% CO ₂ .

細胞は培養皿に接着せずに浮遊状態のまま増殖し、３～４日後には細胞数が１０個以上の細胞塊を多数形成した。更に培養を継続し、細胞塊の直径が５００～６０μｍに到達した時点で、遠心分離により胚葉体様細胞塊を回収し、ポリＨＥＭＡ無処理の３．５ｃｍ培養皿（Iwaki）で上記と同様の培地、培養条件で接着培養を継続すると、ヒドロキサム酸処理開始後１４日間程で、実施例１で見られた幹細胞様コロニーが多数出現した（図５）。当該コロニーの継代培養を数代行うことにより、幹細胞誘導処理（ヒドロキサム酸との共培養）開始後約３～４週間で幹細胞様株を樹立できた。なお、ヒドロキサム酸との共培養処理は幹細胞様コロニーが多数出現した時点で（開始後約１４日間前後）、適宜停止した。その後は無添加にて通常の幹細胞培地で培養を継続した。 The cells proliferated in a floating state without adhering to the culture dish, and after 3 to 4 days formed many cell clusters with 10 or more cells. The culture was further continued, and when the diameter of the cell mass reached 500 to 60 μm, the embryoid body-like cell mass was collected by centrifugation and treated with a 3.5 cm culture dish (Iwaki) not treated with poly-HEMA in the same manner as above. When adhesion culture was continued under medium and culture conditions, a large number of stem cell-like colonies observed in Example 1 appeared about 14 days after the start of hydroxamic acid treatment (Fig. 5). A stem cell-like strain could be established about 3 to 4 weeks after the initiation of stem cell induction treatment (co-culture with hydroxamic acid) by subculturing the colony several times. The co-culture treatment with hydroxamic acid was appropriately stopped when a large number of stem cell-like colonies appeared (around 14 days after initiation). After that, culture was continued in a normal stem cell medium without additives.

上記の様にして、樹立されたＮＨＤＦ細胞由来幹細胞様細胞の幹細胞としての多能性と未分化性の有無を、継代数１８の細胞を用いて、細胞免疫学的に解析した。具体的には、前記幹細胞様細胞は、幹細胞マーカーであるＯＣＴ４、ＳＯＸ－２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＳＴＡＴ３、ＧＡＴＡ４の各抗体に対して陽性反応を示した（図６）。 The presence or absence of pluripotency and undifferentiation as stem cells of the NHDF cell-derived stem cell-like cells established as described above was analyzed cytoimmunologically using 18-passage cells. Specifically, the stem cell-like cells showed positive reactions to each antibody of stem cell markers OCT4, SOX-2, c-MYC, KLF4, STAT3 and GATA4 (Fig. 6).

更に、多能性の保持の有無、並びに癌形成力の有無を確認する為の解析を、以下の様に行った。即ち継代数１８のＮＨＤＦ細胞由来幹細胞様細胞を、免疫不全ＳＣＩＤマウスの睾丸内組織に、約１×１０^６個細胞を１ｍＬの１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地に拡散して注入した。比較対照の為、マウスＴＴ２ＥＳ細胞を同程度の細胞数にして、反対側の睾丸に移植した。約１ヶ月後、睾丸を摘出したところ、ＮＨＤＦ細胞由来幹細胞を移植した睾丸にテラトーマ形成が認められなかった一方、ＴＴ２マウスＥＳ細胞移植の睾丸はテラトーマが形成された（図７）。従って本幹細胞様細胞は、癌形成リスクの低減化が明瞭に確認された。 Furthermore, analysis for confirming the presence or absence of maintenance of pluripotency and the presence or absence of cancer-forming ability was performed as follows. That is, NHDF cell-derived stem-like cells at passage number 18 were injected into the intratesticular tissue of immunodeficient SCID mice by spreading about 1×10 ⁶ cells in 1 mL of 10% FCS-containing DMEM medium. For comparison, mouse TT2 ES cells were transplanted into the contralateral testis with similar cell numbers. About one month later, when the testes were removed, teratoma formation was not observed in the testicles transplanted with NHDF cell-derived stem cells, whereas teratoma formation was observed in the testicles transplanted with TT2 mouse ES cells (Fig. 7). Therefore, it was clearly confirmed that this stem cell-like cell has a reduced risk of carcinogenesis.

更に、上記ヒトＮＨＤＦ細胞の多分化能力の解析を、浮遊培養法により胚葉体様細胞塊を形成させてから、組織学的に行った。即ち、継代数２０の細胞を、トリプシン処理により単一細胞に分散させ、遠心分離により細胞を回収した。その後、回収した細胞を約１×１０^６個細胞／ｍＬの濃度で、前述した浮遊培養法と同様にポリＨＥＭＡを処理し、細胞非接着性とした３．５ｃｍ培養皿（Corning）において浮遊培養により、細胞を胚葉体構造に誘導した。 Furthermore, the pluripotency of the human NHDF cells was analyzed histologically after formation of embryoid body-like cell clusters by the suspension culture method. Briefly, cells at passage number 20 were dispersed into single cells by trypsinization, and cells were collected by centrifugation. Thereafter, the collected cells were treated with poly-HEMA at a concentration of about 1×10 ⁶ cells/mL in the same manner as in the suspension culture method described above, and suspended in a 3.5 cm culture dish (Corning) made non-adhesive. induced cells into embryoid body structures.

《神経細胞への分化誘導》
ＦＣＳ１％、ＦＧＦ２及びＥＧＦを各々１０μｇ／ｍＬ濃度で含有するＤＭＥＭ培地で、上記幹細胞様細胞に浮遊培養を施した。開始後３～４日で胚葉体が形成され（図８Ｄ）、更に１０日～１４日間培養を継続して、得られた胚葉体を組織学的に解析したところ、外胚葉組織である神経膠様細胞の形成が認められた（図８Ａ）。 《Induction of differentiation into nerve cells》
The stem cell-like cells were subjected to suspension culture in a DMEM medium containing 1% FCS, FGF2 and EGF each at a concentration of 10 μg/mL. Embryoid bodies were formed 3 to 4 days after initiation (Fig. 8D), culture was continued for 10 to 14 days, and the obtained embryoid bodies were histologically analyzed. Formation of like cells was observed (Fig. 8A).

《内皮細胞への分化誘導》
上記と同様の手法で、血管内皮細胞増殖因子（VEGF, Sigma）を５０ｎｇ／ｍＬで含有し、ＦＣＳ１０％を添加したＤＭＥＭ培地で１４日～２０日間浮遊培養を行った。得られた胚葉体は消化管内皮様細胞（中胚葉組織）の形成が認められた（図８Ｂ）。 《Induction of differentiation into endothelial cells》
Suspension culture was performed for 14 to 20 days in a DMEM medium supplemented with 10% FCS containing 50 ng/mL of vascular endothelial growth factor (VEGF, Sigma) in the same manner as above. Formation of gastrointestinal endothelium-like cells (mesoderm tissue) was observed in the obtained embryoid body (Fig. 8B).

《肝細胞への分化誘導》
更に上記と同様の手法で、ＦＧＦ４（Sigma）、ＨＧＦ（Sigma）を１０μｇ／ｍＬ濃度で含有し、ＦＣＳを１０％添加したＤＭＥＭ培地で１４日間培養することにより、内胚葉組織である肝細胞様細胞の形成が認められた（図８Ｃ）。 《Induction of differentiation into hepatocytes》
Furthermore, in the same manner as above, FGF4 (Sigma), HGF (Sigma) at a concentration of 10 μg / mL, by culturing for 14 days in DMEM medium supplemented with 10% FCS, hepatocyte-like endoderm tissue Cell formation was observed (Fig. 8C).

上記の結果により、上記ＮＨＤＦ幹細胞様細胞は体外培養系で多分化能力を示すことが証明された。 The above results demonstrate that the NHDF stem cell-like cells exhibit pluripotency in an in vitro culture system.

《実施例３》ヒト羊膜細胞のヒドロキサム酸添加培養による幹細胞への誘導並びに癌細胞化リスク低減性の確認
凍結保存中のヒト羊膜由来繊維芽細胞を融解後、実施例１及び２に既述した方法と同様に増殖培養を行い、実験に用いる細胞材料とした。コンフルエントに達したヒト羊膜由来初代細胞を０．２５％トリプシン処理し、遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞を約１×１０^６個細胞／ｍＬの濃度で実施例２と同条件の設定で、スベロイルビスヒドロキサム酸（Cosmo Bio）を１００μｇ／ｍＬ濃度で含有し、更に１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）、抗生物質－抗菌剤（Gibco）、１０ｎｇ／ｍＬ－ＬＩＦ（Sigma）、１０μｇ／ｍＬ－ＢＭＰ４（Sigma）及び１０ｎｇ／ｍＬ－ＩＧＦＢＰ３（Sigma）を加えたＭＥＭα培地（Gibco）２ｍＬに分散させた後、ポリＨＥＭＡ塗布培養皿（３．５ｃｍ、Nunc）に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養を開始した。
細胞は浮遊状態のまま増殖を続け、培養開始後７～８日で直径５００～６００μｍの胚葉体様細胞塊が多数出現した。実施例２と同様に、遠心分離により上記胚葉体様細胞塊を回収し、ポリＨＥＭＡ無処理の３．５ｃｍ培養皿（Nunc）で、上記と同様の培地、培養条件で培養を継続すると、ヒドロキサム酸処理開始後１０～１４日程で幹細胞様コロニーが出現した（図９）。当該コロニーの継代培養を数代行うことにより、幹細胞誘導処理培養の開始後約３週間で幹細胞様細胞株を樹立した。ヒドロキサム酸との共培養処理は、実施例２と同様幹細胞様コロニーが出現した時点で停止した。
前記幹細胞様細胞は、幹細胞としての細胞生物学的特徴を有することが確認された。即ち、前記幹細胞様細胞は、（１）幹細胞マーカー遺伝子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、ＳＴＡＴ３、及びＧＡＴＡ４の発現が陽性であることがＲＴ－ＰＣＲ法にて確認され（図１０）、（２）アルカリフォスファターゼ活性が陽性であることが確認された（図１１）。更に（３）継代数１５の細胞で、正常核型（４６ＸＸ）であることを確認した。以上により、上記羊膜由来幹細胞様細胞が、幹細胞の特徴を備えていることが証明された。 <<Example 3>> Induction of stem cells by hydroxamic acid-added culture of human amniotic cells and confirmation of reduction in risk of cancer cell formation After thawing the human amnion-derived fibroblasts during cryopreservation, the above-described examples 1 and 2 were performed. Proliferation culture was performed in the same manner as in the method, and cell materials used in experiments were obtained. Human amnion-derived primary cells that had reached confluency were treated with 0.25% trypsin, and the cells were recovered by centrifugation. The obtained cells were set at a concentration of about 1×10 ⁶ cells/mL under the same conditions as in Example 2, containing suberoyl bishydroxamic acid (Cosmo Bio) at a concentration of 100 μg/mL, and further added with 10% FCS ( Gibco), antibiotic-antimicrobial agent (Gibco), 10 ng/mL-LIF (Sigma), 10 μg/mL-BMP4 (Sigma) and 10 ng/mL-IGFBP3 (Sigma) were added to 2 mL of MEMα medium (Gibco). After that, the cells were seeded on a polyHEMA-coated culture dish (3.5 cm, Nunc), and culture was started under conditions of 37° C. and 5% CO ₂ .
The cells continued to proliferate in a floating state, and a large number of embryoid body-like cell clusters with a diameter of 500 to 600 μm appeared 7 to 8 days after the initiation of culture. In the same manner as in Example 2, the embryoid body-like cell mass was collected by centrifugation and cultured in a 3.5 cm culture dish (Nunc) not treated with poly-HEMA under the same medium and culture conditions as described above. Stem cell-like colonies appeared 10 to 14 days after the start of acid treatment (Fig. 9). A stem cell-like cell line was established about 3 weeks after the initiation of the stem cell induction treatment culture by subculturing the colony several times. The co-culture treatment with hydroxamic acid was stopped when stem cell-like colonies appeared as in Example 2.
The stem cell-like cells were confirmed to have cell biological characteristics as stem cells. That is, the stem cell-like cells were confirmed by RT-PCR that the expression of (1) stem cell marker genes OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, STAT3, and GATA4 was positive (Fig. 10), ( 2) Positive alkaline phosphatase activity was confirmed (Fig. 11). Furthermore, (3) cells at passage number 15 were confirmed to have a normal karyotype (46XX). From the above, it was proved that the amnion-derived stem cell-like cells have the characteristics of stem cells.

上記ヒト羊膜由来幹細胞様細胞の多分化能力の解析は、以下の様に行った。継代数１５のヒト羊膜由来幹細胞を、特開２００５－１５１９０７号公報に記載の方法に準じ、ＥＧＦ（Sigma）、ＦＧＦ２（Sigma）、及びＦＧＦ９（Sigma）をそれぞれ２０ｎｇ／ｍＬ濃度で含有するＭＥＭα（Gibco）培地で、１４～２１日間接着培養し、その結果、アストロサイトマーカー及び神経幹細胞マーカーであるＧＦＡＰ，ネスチン、又はＴｕｊｉ１各抗体に陽性反応を示す神経細胞への分化が確認された（外胚葉への分化を示す能力、図１２Ａ）。
更に、上記ヒト羊膜細胞由来幹細胞様細胞を、ＶＥＧＦ（Sigma）を５０ｎｇ／ｍＬ濃度で含有し且つＦＣＳ１０％を添加したＭＥＭα培地で１４～２１日間培養を開始した。その結果、血球系の形態を示す細胞コロニーが出現し、それらの形態を示す血球細胞は血球マーカーであるＣＤ４５に対する抗体に陽性反応を示した（中胚葉への分化能力、図１２Ｂ）。
一方、上記ヒト羊膜由来幹細胞様細胞を、ＦＧＦ４（Sigma）、及びＨＧＦ（Sigma）を２０ｎｇ／ｍＬ濃度で含有し、且つＦＣＳ１０％を添加したＭＥＭα培地で１４日間培養することにより、α－フェトプロテイン抗体に陽性の肝細胞様形態が認められた（内胚葉への分化能力、図１２Ｃ）。
以上の結果により、ヒト羊膜細胞由来幹細胞様細胞が、体外培養系で多分化能力を有することが確認された。なお、上記で使用した各種抗体のうち、α－フェトプロテインをコスモバイオより購入した以外は全てＳｉｇｍａより購入した。抗体は、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（FITC）標識されたものを用いた。 Analysis of the pluripotency of the human amnion-derived stem cell-like cells was performed as follows. Human amnion-derived stem cells at passage number 15 were prepared according to the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-151907, and MEM α containing EGF (Sigma), FGF2 (Sigma), and FGF9 (Sigma) at a concentration of 20 ng/mL each Gibco) medium for 14 to 21 days of adherent culture, and as a result, differentiation into neurons showing positive reaction to each antibody of astrocyte marker and neural stem cell marker GFAP, Nestin, or Tuji1 was confirmed (ectoderm Ability to show differentiation into , Fig. 12A).
Furthermore, the human amniocyte-derived stem cell-like cells were cultured for 14 to 21 days in MEMα medium containing VEGF (Sigma) at a concentration of 50 ng/mL and supplemented with 10% FCS. As a result, cell colonies exhibiting the morphology of blood cells appeared, and the blood cells exhibiting these morphologies showed a positive reaction to an antibody against the blood cell marker CD45 (potential for differentiation into mesoderm, FIG. 12B).
On the other hand, the human amniotic membrane-derived stem cell-like cells were cultured for 14 days in MEMα medium containing FGF4 (Sigma) and HGF (Sigma) at a concentration of 20 ng/mL and supplemented with 10% FCS to obtain an α-fetoprotein antibody. A positive hepatocyte-like morphology was observed in the cells (potential to differentiate into endoderm, FIG. 12C).
Based on the above results, it was confirmed that the human amniocyte-derived stem cell-like cells have pluripotency in an in vitro culture system. All of the antibodies used above were purchased from Sigma, except for α-fetoprotein, which was purchased from Cosmo Bio. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled antibodies were used.

更に、多能性の保持の有無並びに癌形成リスク低減化力の有無を確認する為の解析を、実施例２に準じた方法で行った。即ち、継代数１５の羊膜由来幹細胞様細胞を、免疫不全ＳＣＩＤマウスの睾丸組織内に約１×１０^６個細胞／ｍＬ濃度として、１ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に拡散させて注入した。対照としてマウスＴＴ２ＥＳ細胞を同程度の細胞数として反対側睾丸に移植した。約３０日後、睾丸を摘出したところ、ヒト羊膜細胞由来幹細胞を移植した睾丸にはテラトーマ形成が殆ど認められなかったのに対し、ＴＴ２マウスＥＳ細胞を移植された睾丸にはテラトーマ形成が確認された（図１３）。この結果により、本幹細胞様細胞には、癌形成リスクの低減化が明らかに認められた。 Further, an analysis for confirming the presence or absence of maintenance of pluripotency and the presence or absence of the ability to reduce the risk of cancer formation was performed according to the method of Example 2. That is, amnion-derived stem cell-like cells at passage number 15 were diffused into 1 mL of DMEM medium containing 10% FBS and injected into the testicular tissue of immunodeficient SCID mice at a concentration of about 1×10 ⁶ cells/mL. As a control, mouse TT2 ES cells were transplanted into the contralateral testis with a similar number of cells. About 30 days later, when the testes were removed, almost no teratoma formation was observed in the testicles transplanted with human amnion cell-derived stem cells, whereas teratoma formation was confirmed in the testicles transplanted with TT2 mouse ES cells. (Fig. 13). From this result, it was clearly recognized that the risk of cancer formation was reduced in this stem cell-like cell.

以上の結果より、ヒト羊膜幹細胞様細胞は、培養条件下で多分化能力を有しつつ、癌形成リスク低減性のある幹細胞であることが明らかとなった。 From the above results, it was revealed that the human amniotic stem cell-like cells are stem cells that have pluripotency under culture conditions and have the ability to reduce the risk of cancer formation.

本発明の製造方法により製造された幹細胞は、臨床応用分野のみならず、細胞医学、薬学、工学、農学、獣医学各分野の研究発展に非常に有益である。また、本発明の製造方法により製造された幹細胞は、生体内もしくは生体外培養系における細胞の分化転換制御メカニズムの解明や、生殖医学、分子生物学、発生学の研究材料としても利用可能である。
一方、本発明の製造方法により製造された幹細胞は、所望の分化細胞に分化誘導後、体外培養系を用いた種々の医療用細胞として、又は組織、もしくは器官の再生医療用材料として、好適に用いられ得る。また、本発明の癌細胞化リスク低減化法により、癌細胞化リスクが低減された幹細胞は、再生医療用基盤材料や化粧品用素材として使用することができる。更に、ＪＤＰ２遺伝子の発現抑制剤を開発し、新規抗癌剤として臨床に応用することができる。 Stem cells produced by the production method of the present invention are extremely useful not only for clinical applications but also for research and development in the fields of cell medicine, pharmacy, engineering, agriculture and veterinary medicine. In addition, the stem cells produced by the production method of the present invention can be used as materials for elucidation of cell differentiation control mechanisms in in vivo or in vitro culture systems, reproductive medicine, molecular biology, and embryology. .
On the other hand, the stem cells produced by the production method of the present invention are preferably used as various medical cells using an in vitro culture system or as regenerative medicine materials for tissues or organs after differentiation induction into desired differentiated cells. can be used. In addition, stem cells whose risk of canceration has been reduced by the method for reducing the risk of canceration of the present invention can be used as basic materials for regenerative medicine and cosmetics. Furthermore, a JDP2 gene expression inhibitor can be developed and applied clinically as a novel anticancer agent.