JP3048306B2 - Fibrin degradation product and / or fibrinogen degradation product measuring reagent and method for quantifying the same - Google Patents
- ️Mon Jun 05 2000
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、被検体中のフィブリン
分解産物及び／又はフィブリノーゲン分解産物（以下Ｆ
ＤＰと略す）の量を測定するための免疫試薬、並びにＦ
ＤＰ量を測定するための定量方法に関するものである。The present invention relates to a fibrin degradation product and / or fibrinogen degradation product (hereinafter referred to as F
Immunoreagent for measuring the amount of DP)
The present invention relates to a quantification method for measuring a DP amount.
【０００２】[0002]
【従来の技術】播種性血管内凝固症候群（以下ＤＩＣと
略す）や血栓症の臨床的診断方法としてＦＤＰの測定が
広汎に使用されている。ＤＩＣとは、様々の原因によっ
て、全身の主として細小血管内で血液の凝固を生じ、こ
のため血液中の血小板やフィブリノーゲンをはじめとす
る凝固因子が血液凝固の過程で、または血栓の材料とし
て消費されて低下する症候群である。ＤＩＣが起こると
ＦＤＰの測定値は上昇することが知られている。2. Description of the Related Art FDP measurement is widely used as a clinical diagnostic method for disseminated intravascular coagulation (hereinafter abbreviated as DIC) and thrombosis. DIC is caused by coagulation of blood in various parts of the body, mainly in small blood vessels.Thus, coagulation factors such as platelets and fibrinogen in blood are consumed in the process of blood coagulation or as a material for thrombus. It is a syndrome that decreases. It is known that the measurement of FDP increases when DIC occurs.
【０００３】ＦＤＰの測定には、フィブリノーゲンを免
疫原としてヤギなどの動物に免疫して得られた抗フィブ
リノーゲン抗体を、ラテックス粒子に担持させたラテッ
クス試薬が広く用いられている。該試薬の特徴は、抗原
（フィブリノーゲン又はＦＤＰ）と抗体（抗フィブリノ
ーゲン抗体）による特異的な反応をラテックス粒子の凝
集の度合として捕らえることにある。ラテックス試薬に
は、凝集の度合を定性的に目視で判定するものと、凝集
の度合と光学密度が正の関係にある領域を利用して光学
密度変化量として数値化し定量的に測定する試薬があ
る。定量的に測定するラテックス試薬は、自動分析装置
を利用して簡単な操作で高感度かつ高精度の分析ができ
るという利点を有している。このようなラテックス試薬
では、標準物質として既知濃度のフィブリノーゲン溶液
の光学密度変化量をまず測定し、その光学密度変化量と
濃度の関係から検量線を作成した後、被検体の光学密度
変化量を測定し、検量線よりＦＤＰ濃度を定量的に求め
る方法が一般的である。For the measurement of FDP, a latex reagent in which an anti-fibrinogen antibody obtained by immunizing an animal such as a goat using fibrinogen as an immunogen is supported on latex particles is widely used. A feature of the reagent is that a specific reaction between an antigen (fibrinogen or FDP) and an antibody (anti-fibrinogen antibody) is captured as a degree of aggregation of latex particles. Latex reagents include those that determine the degree of aggregation qualitatively and visually, and those that quantitatively measure the amount of change in optical density using a region where the degree of aggregation and optical density are in a positive relationship. is there. The latex reagent to be quantitatively measured has an advantage that highly sensitive and accurate analysis can be performed by a simple operation using an automatic analyzer. In such a latex reagent, the amount of change in optical density of a fibrinogen solution of a known concentration as a standard substance is first measured, and a calibration curve is created from the relationship between the amount of change in optical density and the concentration. A general method is to measure and quantitatively determine the FDP concentration from a calibration curve.
【０００４】ところが、ＦＤＰ測定試薬では検量線を作
成するための標準物質であるフィブリノーゲンと測定の
目的成分であるＦＤＰが同一物質ではないという点が、
他の測定試薬に比べて特異的である。即ち、ＦＤＰ測定
試薬の原料である抗フィブリノーゲン抗体のフィブリノ
ーゲンに対する反応性とＦＤＰに対する反応性は完全に
同一ではないが故に、試薬原料である抗フィブリノーゲ
ン抗体の違いによって標準物質のフィブリノーゲンと被
検体中のＦＤＰとで反応性が異なることがあり、同じ検
体を測定した時に試薬のロット間で抗フィブリノーゲン
抗体のロット差による測定値の変動を生じるという問題
点がある。However, in the FDP measurement reagent, fibrinogen which is a standard substance for preparing a calibration curve and FDP which is a target component for measurement are not the same substance.
Specific compared to other measurement reagents. That is, since the reactivity of the anti-fibrinogen antibody, which is the raw material of the FDP measurement reagent, to fibrinogen and the reactivity to FDP are not completely the same, the difference between the anti-fibrinogen antibody, which is the reagent raw material, and the fibrinogen of the standard substance and the amount of There is a problem that reactivity may differ between FDP and FDP, and when the same sample is measured, a measurement value may fluctuate due to a lot difference of an anti-fibrinogen antibody between reagent lots.
【０００５】一方、担体を用いた免疫試薬への界面活性
剤の添加技術としては、特開昭６０−５３８４６、特開
平４−９６６５、特開平５−２９７００２等がある。特
開昭６０−５３８４６では、非イオンあるいは陰イオン
界面活性剤を用いて血漿で起こる免疫反応の障害を取り
除く方法が示されている。また、特開平４−９６６５で
は、非イオンと陰イオン界面活性剤を共存させることに
より血中のリポ蛋白を可溶化しアポ蛋白を測定する方法
が開示されている。さらに、特開平５−２９７００２で
は、免疫凝集反応の増感方法として界面活性剤を用いる
ことが開示されている。しかし、本発明のように、陰イ
オン界面活性剤を添加すことによって、標準物質と被検
体に対する抗体の反応性を変化させて、試薬原料である
抗フィブリノーゲン抗体の違いを是正する効果について
は何等知られていない。On the other hand, techniques for adding a surfactant to an immunoreagent using a carrier include JP-A-60-53846, JP-A-4-9665, and JP-A-5-297002. JP-A-60-53846 discloses a method for removing a disorder of an immune reaction occurring in plasma using a nonionic or anionic surfactant. JP-A-4-9665 discloses a method for solubilizing lipoprotein in blood and measuring apoprotein by coexisting a nonionic and anionic surfactant. Further, JP-A-5-297002 discloses that a surfactant is used as a method for sensitizing an immunoagglutination reaction. However, as in the present invention, the effect of adding an anionic surfactant to change the reactivity of the standard substance and the antibody to the analyte to correct the difference between the anti-fibrinogen antibody as the reagent material has no effect. unknown.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】上記のように、ＦＤＰ
測定試薬の原料である抗フィブリノーゲン抗体の違いに
よって、標準物質として用いるフィブリノーゲンと被検
体中ＦＤＰとの間で反応性が異なることがあり、同じ検
体を測定した時に試薬のロット間でＦＤＰの測定値が異
なるという問題点がある。その原因としては用いる抗体
の免疫原の違い、抗体力価の差、動物の個体差等が考え
られる。当然のことながら、試薬ロットが異なっても同
じ検体で同じＦＤＰの測定値が得られることが必要とな
る。従来の技術では、多数の抗フィブリノーゲン抗体を
入手して、その中から前ロットに使用していた抗体と同
等な反応性の抗体を見つけ出すしか手段がないため、労
力がかかるうえに安定に原料の抗体が得られる保証がな
く、安定な試薬供給が難しい。そのため抗体の違いによ
るフィブリノーゲンとＦＤＰとの反応性の差を解消する
技術が望まれている。しかしながら、フィブリノーゲン
とＦＤＰに対する抗体の反応性を調節する技術は未だ報
告されていない。As described above, the FDP
Due to the difference in the anti-fibrinogen antibody, which is the raw material of the measurement reagent, the reactivity may differ between fibrinogen used as a standard substance and the FDP in the test sample. Are different. Possible causes include differences in the immunogen of the antibody used, differences in antibody titers, individual differences in animals, and the like. As a matter of course, it is necessary that the same FDP measurement value is obtained for the same sample even if the reagent lot is different. In the conventional technology, there is no other way but to obtain a large number of anti-fibrinogen antibodies and find out among them the antibodies having the same reactivity as the antibody used in the previous lot. There is no guarantee that antibodies can be obtained, and stable supply of reagents is difficult. Therefore, a technique for eliminating a difference in reactivity between fibrinogen and FDP due to a difference in antibody is desired. However, a technique for regulating the reactivity of an antibody to fibrinogen and FDP has not yet been reported.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究した結果、特定の界面活性
剤を使用することにより解決し得ることを見い出し本発
明に到達したものである。Means for Solving the Problems The inventors of the present invention have made intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that the problems can be solved by using a specific surfactant. It is.
【０００８】即ち本発明者らは、抗フィブリノーゲン抗
体を不溶性担体に担持した担持粒子と、フィブリノーゲ
ンあるいはＦＤＰとを陰イオン界面活性剤存在下で反応
させると陰イオン界面活性剤不存在下に比べ、免疫的凝
集反応の速度が低下することを見出した。また同時に、
陰イオン界面活性剤存在下の反応においては、抗フィブ
リノーゲン抗体担持粒子とフィブリノーゲンとの間で起
こる凝集反応の速度低下が、ＦＤＰとの凝集反応の場合
に比較してより大きいことを見出した。つまり、陰イオ
ン界面活性剤の添加によって、標準物質であるフィブリ
ノーゲンの光学密度変化量が低下するために検量線の傾
きが低下する。一方、被検体中のＦＤＰの光学密度変化
量の低下は小さく、従って、検量線から計算して求めら
れる被検体中のＦＤＰの測定値が相対的に上昇すること
が明らかになった。この現象を利用して、抗フィブリノ
ーゲン抗体の違いによって起こるフィブリノーゲンとＦ
ＤＰの反応性の違いを陰イオン界面活性剤の添加濃度を
調節することによって解消することに成功した。なお、
この現象は陰イオン界面活性剤において特異的に認めら
れる現象であり、非イオン界面活性剤及び陽イオン界面
活性剤では観察されなかった。That is, the inventors of the present invention have found that the reaction between the particles carrying an anti-fibrinogen antibody on an insoluble carrier and fibrinogen or FDP in the presence of an anionic surfactant, compared to the absence of an anionic surfactant, It has been found that the rate of immunological agglutination is reduced. At the same time,
In the reaction in the presence of the anionic surfactant, it was found that the rate of the agglutination reaction between the particles carrying the anti-fibrinogen antibody and fibrinogen was lower than that in the case of the agglutination reaction with FDP. That is, the addition of the anionic surfactant reduces the change in the optical density of fibrinogen, which is the standard substance, so that the slope of the calibration curve decreases. On the other hand, it was revealed that the decrease in the optical density change amount of the FDP in the subject was small, and therefore, the measured value of the FDP in the subject, which was calculated from the calibration curve, relatively increased. Utilizing this phenomenon, fibrinogen and F caused by differences in anti-fibrinogen antibodies
The difference in DP reactivity was successfully eliminated by adjusting the concentration of the added anionic surfactant. In addition,
This phenomenon was observed specifically for anionic surfactants, and was not observed for nonionic surfactants and cationic surfactants.
【０００９】本発明のＦＤＰ測定試薬は、抗フィブリノ
ーゲン抗体を不溶性担体に担持した担持粒子、緩衝液、
及び陰イオン界面活性剤から構成され、そのことにより
前記目的が達成される。[0009] The FDP measurement reagent of the present invention comprises a carrier particle carrying an anti-fibrinogen antibody on an insoluble carrier, a buffer,
And an anionic surfactant, whereby the object is achieved.
【００１０】本発明の定量方法は、抗フィブリノーゲン
抗体を不溶性担体に担持した担持粒子とＦＤＰを含む被
検体を接触させて免疫反応に伴う凝集の度合によって被
検体中のＦＤＰ量を測定する際に、陰イオン界面活性剤
の存在下に当該免疫反応を行うことを特徴とし、そのこ
とにより前記目的が達成される。従って、陰イオン界面
活性剤は少なくとも抗原（ＦＤＰ）と抗体との免疫反応
時に存在すればよく、陰イオン界面活性剤の添加方法、
添加順序には何等制限はない。測定試薬中に予め含有さ
せておくのが最も一般的である。[0010] The quantification method of the present invention is useful for measuring the amount of FDP in a subject by measuring the amount of FDP based on the degree of agglutination caused by an immune reaction by contacting the subject containing FDP with particles carrying an anti-fibrinogen antibody on an insoluble carrier. The immunoreaction is performed in the presence of an anionic surfactant, thereby achieving the above object. Therefore, the anionic surfactant only needs to be present at least at the time of the immune reaction between the antigen (FDP) and the antibody.
There is no restriction on the order of addition. Most commonly, it is previously contained in the measurement reagent.
【００１１】本発明に用いる抗フィブリノーゲン抗体
は、ヒトフィブリノーゲンを免疫原として、ウサギ、ヤ
ギ、ヒツジなどの動物を免疫して得た抗血清より調製さ
れる。非特異反応を防ぐために、抗血清から免疫グロブ
リン（ＩｇＧ）に精製したもの、あるいはＩｇＧの断
片、例えばF(ab')2 が好適に使用される。また、ヒトフ
ィブリノーゲンと反応するモノクローナル抗体を利用す
ることもできる。The anti-fibrinogen antibody used in the present invention is prepared from an antiserum obtained by immunizing animals such as rabbits, goats and sheep using human fibrinogen as an immunogen. In order to prevent nonspecific reaction, immunoglobulin (IgG) purified from antiserum, or an IgG fragment such as F (ab ') 2 is preferably used. Also, a monoclonal antibody that reacts with human fibrinogen can be used.
【００１２】本発明で用いられる不溶性担体としては、
有機高分子粒子、無機物質粒子、赤血球などが挙げられ
る。有機高分子粒子としては、不溶性アガロース、セル
ロース、不溶性デキストランなどの粒子が例示でき、好
ましくはラテックス粒子が良い。該ラテックス粒子とし
ては、例えばポリスチレン、スチレン−メタクリル酸共
重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリレート共
重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メ
タクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリ
ルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル
酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなど
の粒子が挙げられる。用いるラテックス粒子の平均粒径
は、測定機器などによって０．０５〜０．５０μｍのも
のが適宜選択される。無機物質粒子としてはシリカ、ア
ルミナなどが挙げられる。The insoluble carrier used in the present invention includes:
Organic polymer particles, inorganic substance particles, erythrocytes and the like can be mentioned. Examples of the organic polymer particles include particles such as insoluble agarose, cellulose, and insoluble dextran, and latex particles are preferable. Examples of the latex particles include polystyrene, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylate copolymer, styrene-styrene sulfonate copolymer, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer, acrylonitrile butadiene. Examples include particles of styrene copolymer, vinyl chloride-acrylate copolymer, polyvinyl acetate acrylate, and the like. The average particle size of the latex particles to be used is appropriately selected from those of 0.05 to 0.50 μm depending on a measuring instrument or the like. Examples of the inorganic substance particles include silica and alumina.
【００１３】抗フィブリノーゲン抗体を不溶性担体に担
持させる方法としては、物理的吸着法と化学的結合法が
あり、担持操作の簡便性という点で物理的吸着法が好適
に使用される。As a method for supporting the anti-fibrinogen antibody on the insoluble carrier, there are a physical adsorption method and a chemical bonding method, and the physical adsorption method is suitably used in view of the simplicity of the operation of the support.
【００１４】抗フィブリノーゲン抗体の不溶性担体への
担持量は必ずしも正確に把握出来ないが、通常緩衝液等
の媒体中で不溶性担体１ｇ当り５０〜１０００ｍｇの抗
体を用いて担持操作を行い、その後遠心分離等により担
持粒子を取り出し試薬原料とする。[0014] The amount of the anti-fibrinogen antibody carried on the insoluble carrier cannot always be accurately determined, but the carrying operation is usually carried out in a medium such as a buffer using 50 to 1000 mg of the antibody per gram of the insoluble carrier, followed by centrifugation. The carrier particles are taken out as described above and used as a reagent material.
【００１５】本発明で用いられる緩衝液としては、被検
体中のＦＤＰを失活させることがなく、かつ、抗原抗体
反応を阻害しないようなイオン強度やｐＨを有するもの
であればよい。例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝
液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が使用される。反応
のｐＨは、５〜１０特にｐＨ６〜９が好ましい。The buffer used in the present invention may be any buffer that does not deactivate FDP in the subject and has an ionic strength and pH that does not inhibit the antigen-antibody reaction. For example, phosphate buffer, glycine buffer, Tris buffer, Good buffer and the like are used. The pH of the reaction is preferably 5 to 10, particularly preferably 6 to 9.
【００１６】本発明に用いられる陰イオン界面活性剤と
しては、ラウリル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略
す）、ミリスチル硫酸ナトリウム、セチル硫酸ナトリウ
ム等のアルキル硫酸塩、あるいはドデシルベンゼンスル
ホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、
あるいはラウリルスルホ酢酸ナトリウム、ジ２−エチル
ヘキシルスルホコハク酸ナトリウム等のスルホン酸塩な
どが挙げられる。該陰イオン界面活性剤の濃度は、被検
体と測定試薬を混合して定量を行う際の混合液中の濃度
が０．０００２〜０．０１５％（ｗ／ｖ）になるように
測定試薬中に配合することが好ましい。また、その配合
量は用いる抗フィブリノーゲン抗体毎に所定の液のＦＤ
Ｐの測定値が一定になるように各々決定される。測定時
の濃度が０．０００２％（ｗ／ｖ）より低い場合は抗体
ロット間の反応性を調節する効果が小さく、また、０．
０１５％（ｗ／ｖ）より高い場合は検量線が再現性よく
得られない傾向がある。The anionic surfactant used in the present invention includes alkyl sulfates such as sodium lauryl sulfate (hereinafter abbreviated as SDS), sodium myristyl sulfate and sodium cetyl sulfate, and alkylbenzene sulfonic acids such as sodium dodecylbenzene sulfonate. salt,
Alternatively, sulfonates such as sodium lauryl sulfoacetate and sodium di-2-ethylhexyl sulfosuccinate may be used. The concentration of the anionic surfactant in the measurement reagent is adjusted so that the concentration in the mixed solution when the analyte and the measurement reagent are mixed and quantified is 0.0002 to 0.015% (w / v). It is preferable to mix them. In addition, the amount of the FD of a predetermined liquid is determined for each anti-fibrinogen antibody used.
Each is determined so that the measured value of P is constant. When the concentration at the time of measurement is lower than 0.0002% (w / v), the effect of regulating the reactivity between antibody lots is small,
When it is higher than 015% (w / v), the calibration curve tends not to be obtained with good reproducibility.
【００１７】他の界面活性剤、即ち非イオン界面活性剤
には前記目的を達成できるような効果がなく、また陽イ
オン界面活性剤では非特異的な凝集反応が起こり不適当
である。Other surfactants, ie, nonionic surfactants, have no effect to achieve the above-mentioned purpose, and cationic surfactants are unsuitable due to nonspecific agglutination.
【００１８】本発明の被検体中のＦＤＰ量を測定する場
合の測定試薬としては、前述のラテックス粒子を用いる
ラテックスの凝集反応を利用したラテックス測定試薬が
好適に使用される。この不溶性担体としてラテックス粒
子を用いるＦＤＰ測定試薬においては、抗フィブリノー
ゲン抗体をラテックス粒子に担持した担持ラテックス粒
子を緩衝液に懸濁させてなるラテックス懸濁液（甲剤）
と、陰イオン界面活性剤を緩衝液に溶解させてなる溶液
（乙剤）との二液型の試薬とするのが好ましい態様であ
る。As the measuring reagent for measuring the amount of FDP in the subject of the present invention, a latex measuring reagent utilizing the latex agglutination reaction using latex particles described above is suitably used. In the FDP measurement reagent using latex particles as the insoluble carrier, a latex suspension (supplement) is prepared by suspending a supported latex particle having an anti-fibrinogen antibody on latex particles in a buffer.
In a preferred embodiment, the reagent is a two-pack type reagent consisting of a solution prepared by dissolving an anionic surfactant in a buffer solution (B).
【００１９】以下に本発明の好ましい二液型からなる試
薬形態を示すが、例示する物質及び各物質の濃度は、試
薬として代表的なものを例示するものであって、本発明
を限定するものではない。The preferred two-part reagent form of the present invention is shown below. The exemplified substances and the concentrations of each substance are representative of typical reagents and are not intended to limit the present invention. is not.
【００２０】甲剤； （１）緩衝液 ５０〜３００ｍＭ、ｐＨ６〜９ （２）抗フィブリノーゲン抗体を担持したラテックス粒
子 ０．１〜０．５％（ｗ／ｖ） （３）塩化ナトリウム ５０〜３００ｍＭ 乙剤； （４）緩衝液 ５０〜３００ｍＭ、ｐＨ６〜９ （５）塩化ナトリウム ５０〜３００ｍＭ （６）陰イオン界面活性剤 ０．０００２〜０．０２％
（ｗ／ｖ） 上記測定試薬を用いて定量する場合は、乙剤と被検体を
反応セル中で混合した後甲剤を添加して光学密度変化量
を測定する方法や、甲剤と乙剤を反応セル中で混合した
後被検体を添加して光学密度変化量を測定する方法等が
採用される。(1) Buffer 50-300 mM, pH 6-9 (2) Latex particles carrying anti-fibrinogen antibody 0.1-0.5% (w / v) (3) Sodium chloride 50-300 mM (4) Buffer 50-300 mM, pH 6-9 (5) Sodium chloride 50-300 mM (6) Anionic surfactant 0.0002-0.02%
(W / v) In the case of quantification using the above-mentioned measurement reagent, a method of mixing the agent B and the analyte in a reaction cell and then adding the agent A to measure the optical density change amount, or a method of mixing the agent A and the agent B Are mixed in a reaction cell, and then an analyte is added thereto, and the amount of change in optical density is measured.
【００２１】本発明の測定試薬は、被検体中のフィブリ
ン分解産物及び／又はフィブリノーゲン分解産物を測定
することが可能である。被検体としては、血清、尿等が
対象となるが、血清中には、フィブリノーゲン分解産物
とフィブリン分解産物が共存するので、通常その両者を
合わせて測定することになる。本試薬は、フィブリノー
ゲン分解産物、あるいはフィブリン分解産物が単独で存
在する場合には、その各々を測定することができる。The measuring reagent of the present invention can measure a fibrin degradation product and / or a fibrinogen degradation product in a test sample. Serum, urine, and the like can be used as a subject, but since fibrinogen degradation products and fibrin degradation products coexist in serum, both of them are usually measured together. When a fibrinogen degradation product or a fibrin degradation product is present alone, the present reagent can measure each of them.
【００２２】本発明では例えば上記例示形態の試薬を用
いて凝集反応を行い、既知濃度のフィブリノーゲン溶液
と被検体の各々について生じた凝集の度合を光学的に観
察し比較することで被検体中のＦＤＰ濃度が測定され得
る。具体的には、まず既知濃度のフィブリノーゲン溶液
を二濃度（フィブリノーゲン濃度０μｇ／ｍｌの溶液を
含むのが好ましい）以上測定し、得られた光学密度変化
量とフィブリノーゲン濃度の関係から検量線を作成す
る。次に被検体を測定しその光学密度変化量から検量線
を利用して濃度を求め、その値をＦＤＰ濃度とする。担
持粒子の凝集の度合を光学的に検出する方法において
は、測定は散乱光強度、吸光度または透過光強度を測定
する光学機器で行う。測定波長は３００〜２４００ｎｍ
の範囲から適切な波長が選択される。定量方法について
は公知の方法に従い、用いる不溶性担体の粒子の大きさ
あるいは濃度の選択、反応時間の設定により、散乱光強
度、吸光度または透過光強度の増加もしくは減少を測定
することにより行われる。また、これらの方法を併用す
ることも可能である。In the present invention, for example, an agglutination reaction is carried out using the reagent of the above-described embodiment, and the degree of agglutination generated for each of the test sample and the fibrinogen solution having a known concentration is optically observed and compared to obtain a test result. FDP concentration can be measured. Specifically, first, a fibrinogen solution having a known concentration is measured at two or more concentrations (preferably containing a solution having a fibrinogen concentration of 0 μg / ml) or more, and a calibration curve is created from the relationship between the obtained optical density change amount and the fibrinogen concentration. . Next, the subject is measured, the concentration is determined from the change in optical density using a calibration curve, and the value is defined as the FDP concentration. In the method of optically detecting the degree of agglomeration of the carrier particles, the measurement is performed with an optical instrument for measuring the scattered light intensity, the absorbance, or the transmitted light intensity. Measurement wavelength is 300-2400nm
An appropriate wavelength is selected from the range. The quantification method is performed by measuring the increase or decrease of the scattered light intensity, the absorbance or the transmitted light intensity by selecting the size or concentration of the particles of the insoluble carrier to be used and setting the reaction time according to a known method. Also, these methods can be used in combination.
【００２３】本発明における免疫反応の条件は公知の条
件が採用されるが、反応時の温度は１０〜５０℃特に２
０〜４０℃が好ましい。反応時間は適宜決定すればよ
い。The conditions of the immune reaction in the present invention are known ones, and the temperature during the reaction is 10 to 50 ° C., especially 2 to 50 ° C.
0-40 ° C is preferred. The reaction time may be appropriately determined.
【００２４】本発明の測定試薬並びに定量方法において
は、非特異反応防止などを目的としてチレンジアミン四
酢酸や塩化コリンなどを、あるいは凝集速度を促進する
ことなどを目的としてポリエチレングリコールやポリビ
ニルピロリドンなどを、更に被検体中の塩濃度の影響を
抑えることなどを目的として塩化ナトリウム等の無機塩
等を使用してもよい。In the measurement reagent and the quantification method of the present invention, tylenediaminetetraacetic acid, choline chloride or the like is used for the purpose of preventing non-specific reactions, or polyethylene glycol or polyvinylpyrrolidone is used for the purpose of accelerating the aggregation rate. An inorganic salt such as sodium chloride may be used for the purpose of suppressing the influence of the salt concentration in the subject.
【００２５】[0025]
【実施例】以下実施例を上げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に記載の範囲に限定される
ものではない。EXAMPLES The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to the scope described in these examples.
【００２６】実施例１〜２ 陰イオン界面活性剤の添加
とＦＤＰ測定値 （１）甲剤（抗フィブリノーゲン抗体担持ラテックス懸
濁液）の調製 平均粒子径０．１６μｍのポリスチレン粒子をｐＨ８．
６の０．０２Ｍグリシン緩衝液（以下ＧＢと略す）で希
釈してラテックス濃度が１％（ｗ／ｖ）の懸濁液を２ｍ
ｌ調製した。次いで抗ヒトフィブリノーゲンヤギ抗体
（抗体Ａ、抗体Ｂあるいは抗体Ｃの三種）をＧＢで希釈
した溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を２ｍｌ加え混合した。３７
℃で２時間振とうした後、ウシ血清アルブミンを１％
（ｗ／ｖ）に調製したものを０．１ｍｌ添加し、さらに
１時間振とうした。次いで遠心分離により、得られた沈
渣（抗フィブリノーゲン抗体担持ラテックス）に８ｍｌ
の０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ８．６の０．１
Ｍグリシン緩衝液（以下ＧＢＳと略す）を加えて懸濁し
て甲剤を調製した。Examples 1-2 Addition of an anionic surfactant and measured value of FDP (1) Preparation of an agent (a latex suspension carrying an anti-fibrinogen antibody) Polystyrene particles having an average particle diameter of 0.16 µm were prepared at pH 8.
6 was diluted with 0.02 M glycine buffer (hereinafter abbreviated as GB) to give a suspension having a latex concentration of 1% (w / v) in 2 m.
1 was prepared. Next, 2 ml of a solution (2 mg / ml) of an anti-human fibrinogen goat antibody (three kinds of antibodies A, B and C) diluted with GB was added and mixed. 37
After shaking at 2 ° C for 2 hours, 1% bovine serum albumin was added.
(W / v) was added to 0.1 ml, and shaken for 1 hour. Then, by centrifugation, 8 ml of the obtained sediment (latex carrying anti-fibrinogen antibody) was added.
0.16 pH 0.1 containing 0.15M sodium chloride
A suppository was prepared by adding and suspending an M glycine buffer (hereinafter abbreviated as GBS).
【００２７】（２）乙剤（陰イオン界面活性剤含有緩衝
液）の調製 ＳＤＳを抗体Ａについては０．００１％（ｗ／ｖ）、抗
体Ｂについては０．００３％（ｗ／ｖ）、抗体Ｃについ
ては０．０２％（ｗ／ｖ）含むＧＢＳを調製して乙剤と
した。又ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを抗体
Ａについては０．０００２５％（ｗ／ｖ）、抗体Ｂにつ
いては０．０００７５％（ｗ／ｖ）、抗体Ｃについては
０．００２％を含むＧＢＳを調製して乙剤とした。(2) Preparation of an agent (buffer containing an anionic surfactant) SDS was 0.001% (w / v) for antibody A, 0.003% (w / v) for antibody B, For antibody C, GBS containing 0.02% (w / v) was prepared and used as an agent. GBS containing 0.00025% (w / v) of sodium dodecylbenzenesulfonate for antibody A, 0.00075% (w / v) of antibody B, and 0.002% of antibody C was prepared. It was made a second agent.
【００２８】（３）ＦＤＰ試薬用標準液の調製 ０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＧＢＳで
ヒトフィブリノーゲン（凍結乾燥品、カビ社）を溶解、
希釈して８０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／
ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌに調製し標準液と
した。(3) Preparation of standard solution for FDP reagent Human fibrinogen (lyophilized product, mold) was dissolved in GBS containing 0.1% (w / v) bovine serum albumin.
Dilute to 80 μg / ml, 40 μg / ml, 20 μg / ml
ml, 10 μg / ml and 5 μg / ml, and used as standard solutions.
【００２９】（４）測定法 乙剤３００μｌに被検体５μｌをガラスセル中で添加攪
拌した後、３７℃で約５分間静置した。次いで甲剤を１
００μｌ添加攪拌し、３０秒後から２００秒までの波長
６６０ｎｍにおける光学密度変化量を測定した。(4) Measuring method 5 μl of a test substance was added to 300 μl of the second agent in a glass cell and stirred, and then allowed to stand at 37 ° C. for about 5 minutes. Then add 1
After adding 00 μl and stirring, the change in optical density at a wavelength of 660 nm from 30 seconds to 200 seconds was measured.
【００３０】（５）測定値算出法 前記測定法でＦＤＰ試薬用標準液と生理食塩水（ブラン
ク）の光学密度変化量を測定して検量線を作成した。測
定は東芝ＴＢＡ−３０Ｒ形自動分析装置（東芝メディカ
ル製）を用いて行った。次いで、被検体を測定して得ら
れた光学密度変化量を用いて検量線からＦＤＰ測定値を
算出した。(5) Measured Value Calculation Method The amount of change in the optical density of the standard solution for FDP reagent and physiological saline (blank) was measured by the above-mentioned measurement method to prepare a calibration curve. The measurement was performed using a Toshiba TBA-30R type automatic analyzer (manufactured by Toshiba Medical). Next, an FDP measurement value was calculated from a calibration curve using the optical density change amount obtained by measuring the subject.
【００３１】（６）被検体中のＦＤＰ濃度 被検体である血清中のＦＤＰ濃度の参考値として、市販
試薬のエルピア・ＦＤＰ（ダイアヤトロン製）で測定し
た結果、９．６μｇ／ｍｌであった。(6) FDP Concentration in Subject As a reference value of the FDP concentration in the serum of the subject, it was 9.6 μg / ml as a result of measurement using a commercial reagent, Elpia FDP (manufactured by Diatron). .
【００３２】（７）抗体ロットと陰イオン界面活性剤添
加とＦＤＰ測定値との関係 異なる抗体ロットより調製した甲剤と種々濃度の陰イオ
ン界面活性剤を含有する乙剤を組み合わせて、血清中の
ＦＤＰを測定した結果を表１に示した。表１の実施例１
に示すように、乙剤中に含有するＳＤＳ濃度を適宜選択
することによって、抗体ロット間で起こるＦＤＰ測定値
の変動をなくすことができた。(7) Relationship between Antibody Lot, Addition of Anionic Surfactant, and FDP Measurement Value The serum prepared by combining an agent prepared from a different antibody lot and an agent containing various concentrations of anionic surfactant was added to the serum. Table 1 shows the results of measuring the FDP of the sample. Example 1 of Table 1
As shown in (2), by appropriately selecting the concentration of SDS contained in the agent B, the fluctuation of the measured FDP value between antibody lots could be eliminated.
【００３３】また、実施例２に示すように、乙剤中に種
々の濃度のドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含
有させることによって、抗体ロット間でＦＤＰ測定値を
一致させることができた。Further, as shown in Example 2, by including various concentrations of sodium dodecylbenzenesulfonate in the second preparation, it was possible to make the FDP measurement values coincide between antibody lots.
【００３４】[0034]
【表１】 [Table 1]
【００３５】比較例１ 抗体ロットと陰イオン界面活性
剤無添加とＦＤＰ測定値との関係 乙剤中に陰イオン界面活性剤を添加しない以外は実施例
と同様の操作で血清中ＦＤＰの測定を行った結果を表１
に示した。比較例１に示すように、乙剤中に陰イオン界
面活性剤を含有しない場合には、抗体ロット間でＦＤＰ
測定値は一定値を示さず、５．１〜８．９μｇ／ｍｌま
で大きく変動した。Comparative Example 1 Relationship between Antibody Lot, No Addition of Anionic Surfactant and FDP Measurement Value The measurement of serum FDP was performed in the same manner as in Example except that no anionic surfactant was added to the second agent. Table 1 shows the results.
It was shown to. As shown in Comparative Example 1, when no anionic surfactant was contained in the second preparation, the FDP was
The measured values did not show a constant value and fluctuated greatly from 5.1 to 8.9 μg / ml.
【００３６】比較例２〜４ 抗体ロットと非イオン界面
活性剤添加とＦＤＰ測定値との関係 陰イオン界面活性剤の代わりに非イオン界面活性剤とし
てＴｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノ
ラウレート）を用いて実施例と同様の操作で測定を行っ
た結果を表１に示した。但し、乙剤中のＴｗｅｅｎ２０
の濃度は、０．００１％、０．００３％、０．０２％
（ｗ／ｖ）で行った。比較例２〜４に示すように、乙剤
中に非イオン界面活性剤を含有させた場合には、どの非
イオン界面活性剤濃度においても、抗体ロット間のＦＤ
Ｐ測定値の変動を調節することができなかった。Comparative Examples 2 to 4 Relationship between Antibody Lot, Addition of Nonionic Surfactant and FDP Measurement Value Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) was used as the nonionic surfactant instead of the anionic surfactant. Table 1 shows the results of the measurement performed in the same manner as in Example. However, Tween 20
Concentration is 0.001%, 0.003%, 0.02%
(W / v). As shown in Comparative Examples 2 to 4, when a nonionic surfactant was contained in the second preparation, FD between antibody lots was observed at any concentration of the nonionic surfactant.
The variation in P measurements could not be adjusted.
【００３７】比較例５〜７ 抗体ロットと陽イオン界面
活性剤とＦＤＰ測定値との関係 陰イオン界面活性剤の代わりに陽イオン界面活性剤とし
て臭化トリデシルトリメチルアンモニウム塩を用いて実
施例と同様の操作で測定を行った。但し、乙剤中の臭化
トリデシルトリメチルアンモニウム塩の濃度は、０．０
０１％、０．００３％、０．０２％（ｗ／ｖ）で行っ
た。比較例５〜７に示すように、乙在中に陽イオン界面
活性剤濃度を含有させた場合には、濃度が低いと効果が
なく、また濃度が高いと非特異的な凝集反応が起きるた
めに検量線を作成することができず、ＦＤＰの測定がで
きなかった。Comparative Examples 5 to 7 Relationship between Antibody Lot, Cationic Surfactant, and FDP Measurement Values Examples were conducted using tridecyltrimethylammonium bromide as a cationic surfactant in place of the anionic surfactant. The measurement was performed by the same operation. However, the concentration of tridecyltrimethylammonium bromide in the agent B is 0.0
Performed at 01%, 0.003%, 0.02% (w / v). As shown in Comparative Examples 5 to 7, when the concentration of the cationic surfactant was contained in the mixture, there was no effect when the concentration was low, and a non-specific agglutination reaction occurred when the concentration was high. A calibration curve could not be prepared, and FDP could not be measured.
【００３８】[0038]
【発明の効果】本発明のＦＤＰ測定試薬は、陰イオン界
面活性剤を添加することにより、フィブリノーゲンとＦ
ＤＰの反応性の差を調節することができ、抗フィブリノ
ーゲン抗体のロット間差等によるフィブリノーゲンとＦ
ＤＰの反応性の差を解消した正確な定量が可能なＦＤＰ
試薬を作製することができるという効果を有する。The FDP measuring reagent of the present invention can be prepared by adding an anionic surfactant to fibrinogen and F.
The difference in reactivity of DP can be adjusted, and fibrinogen and F due to the difference between lots of anti-fibrinogen antibody can be adjusted.
FDP that can accurately quantify the difference in DP reactivity
This has the effect that a reagent can be prepared.
【００３９】[0039]
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平７−12813（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−187862（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−97057（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−53846（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−260163（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−221245（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−248061（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−9665（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−5637（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−52621（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−257363（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−78066（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−58933（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/543 Continuation of front page (56) References JP-A-7-112813 (JP, A) JP-A-58-187862 (JP, A) JP-A-59-97057 (JP, A) JP-A-60-53846 (JP) JP-A-61-260163 (JP, A) JP-A-63-221245 (JP, A) JP-A-1-24861 (JP, A) JP-A-4-9665 (JP, A) JP-A-5-5637 (JP, A) JP-A-53-52621 (JP, A) JP-A-60-257363 (JP, A) JP-A-63-78066 (JP, A) JP-A-6-58933 (JP, A) A) (58) Field surveyed (Int. Cl. 7 , DB name) G01N 33/53 G01N 33/543