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KR102732912B1 - Pharmaceutical Composition For Preventing Or Treating Lung Adenocarcinoma Comprising K-ras Specific Activated T Cell And Manufacturing Method Thereof - Google Patents

  • ️Wed Nov 20 2024

본 발명은 K-ras 특이적 활성화 T 세포 유도용 항원 조성물과 싸이토카인(cytokine)을 이용하여 유도한 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하는 폐 선암종(lung adenocarcinoma)의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 "예방"이란 본 발명의 폐 선암종(lung adenocarcinoma)의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 투여에 의해 암이 억제되거나 지연되는 모든 행위를 의미하며, 본 발명의 "치료"란 폐 선암종(lung adenocarcinoma)의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of lung adenocarcinoma, comprising an antigen composition for inducing K-ras specific activated T cells and K-ras specific activated T cells induced using cytokines. The term "prevention" in the present invention means any act by which cancer is suppressed or delayed by the administration of the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of lung adenocarcinoma of the present invention, and the term "treatment" in the present invention means any act by which the symptoms of cancer are improved or beneficially changed by the administration of the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of lung adenocarcinoma.

본 발명의 폐 선암종(lung adenocarcinoma)은 암세포에서 K-ras, K-ras 돌연변이 G12V, K-ras 돌연변이 G12D, 또는 K-ras 돌연변이 G13D가 검출되는 것을 특징으로 한다. 상기 K-ras의 유전자인 KRAS는 대표적인 원종양유전자(proto-oncogene)로서 척추동물에서 세포의 성장, 분화에 관여하며 점돌연변이(point mutation), 염색체전위(chromosomal translocation), 유전자 증폭(gene amplification)등에 의해 종양유전자(oncogene)로 바뀌는 경우 K-ras의 활성을 비정상적으로 증가시켜 암을 유발한다. 따라서 본 발명의 폐 선암종(lung adenocarcinoma) 암세포에서 K-ras, K-ras 돌연변이 G12V, K-ras 돌연변이 G12D, 또는 K-ras 돌연변이 G13D가 검출된다는 것은 KRAS가 종양유전자로서 발현되어 K-ras의 활성이 비정상적으로 증가된 상태임을 의미한다. 바람직하게는 본 발명의 폐 선암종(lung adenocarcinoma)은 암세포에서 K-ras 돌연변이 G12V, K-ras 돌연변이 G12D, 또는 K-ras 돌연변이 G13D가 검출되는 것을 특징으로 하며 보다 바람직하게는 K-ras 돌연변이 G12D가 검출되는 것을 특징으로 한다.The lung adenocarcinoma of the present invention is characterized in that K-ras, K-ras mutation G12V, K-ras mutation G12D, or K-ras mutation G13D is detected in cancer cells. The K-ras gene, KRAS, is a representative proto-oncogene that is involved in cell growth and differentiation in vertebrates, and when it is changed into an oncogene by point mutation, chromosomal translocation, gene amplification, etc., it abnormally increases the activity of K-ras and causes cancer. Therefore, the detection of K-ras, K-ras mutation G12V, K-ras mutation G12D, or K-ras mutation G13D in the lung adenocarcinoma cancer cells of the present invention means that KRAS is expressed as an oncogene and the activity of K-ras is abnormally increased. Preferably, the lung adenocarcinoma of the present invention is characterized in that K-ras mutation G12V, K-ras mutation G12D, or K-ras mutation G13D is detected in cancer cells, and more preferably, K-ras mutation G12D is detected.

상기 K-ras 돌연변이 G12V, G12D, G13D는 폐선암, 취장선암, 결정선암, 결장직장선암 및 직장선암에서 발견되는 돌연변이로서 GTPase-activating proteins (GAPs)에 의한 GTP hydrolysis가 원활하게 일어나지 못하게 하여 GTP-bound RAS protein의 cellular level을 증가시키고 이로 인하여 하위 신호전달체계를 비정상적으로 활성화시키므로 암세포의 증식을 유도하는 것으로 알려져 있다. The above K-ras mutations G12V, G12D, and G13D are mutations found in lung adenocarcinoma, pancreatic adenocarcinoma, ovarian adenocarcinoma, colorectal adenocarcinoma, and rectal adenocarcinoma. They are known to induce cancer cell proliferation by increasing the cellular level of GTP-bound RAS protein by preventing smooth GTP hydrolysis by GTPase-activating proteins (GAPs), thereby abnormally activating the downstream signaling system.

본 발명의 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하는 폐 선암종(lung adenocarcinoma)의 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 K-ras 특이적 활성화 T 세포 유도용 항원 조성물 및 싸이토카인(cytokine)을 이용하여 유도한 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하므로 K-ras, K-ras 돌연변이 G12V, K-ras 돌연변이 G12D, 또는 K-ras 돌연변이 G13D가 검출되는 폐암, 대장암, 유방암, 흑색종 등의 암 치료에 사용 가능하며 바람직하게는 폐암 중 K-ras, K-ras 돌연변이 G12V, K-ras 돌연변이 G12D, 또는 K-ras 돌연변이 G13D가 검출되는 폐선암종(lung carcinoma)의 치료에 사용 가능하며 보다 바람직하게는 K-ras, K-ras 돌연변이 G12V, K-ras 돌연변이 G12D, 또는 K-ras 돌연변이 G13D가 검출되는 폐 대세포 선암종(lung large cell adenocarcinoma)의 치료에 사용 가능하며 가장 바람직하게는 K-ras 돌연변이 G12D가 검출되는 폐 대세포 선암종(lung large cell adenocarcinoma)의 치료에 사용 가능하다. The pharmaceutical composition for preventing and treating lung adenocarcinoma comprising K-ras specific activated T cells of the present invention comprises an antigen composition for inducing K-ras specific activated T cells and K-ras specific activated T cells induced using cytokines, and therefore can be used for the treatment of cancers such as lung cancer, colon cancer, breast cancer, and melanoma in which K-ras, K-ras mutant G12V, K-ras mutant G12D, or K-ras mutant G13D are detected, and preferably can be used for the treatment of lung carcinoma in which K-ras, K-ras mutant G12V, K-ras mutant G12D, or K-ras mutant G13D are detected, and more preferably can be used for the treatment of lung large cell adenocarcinoma in which K-ras, K-ras mutant G12V, K-ras mutant G12D, or K-ras mutant G13D are detected, and most preferably can be used for the treatment of lung large cell adenocarcinoma in which K-ras, K-ras mutant G12V, K-ras mutant G12D, or K-ras mutant G13D is detected, and most preferably can be used for the treatment of lung large cell adenocarcinoma in which K-ras, K-ras mutant G12D It can be used in the treatment of lung large cell adenocarcinoma that is detected.

본 발명에 기재된 “조성물”은 활성 성분으로서 본 발명에 따른 K-ras 특이적 활성화 T 세포와 함께 천연 또는 인공의 담체, 라벨 또는 탐지제와 같은 불활성 성분 또는 애주번트, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친지방성 용매, 보존제와 같은 활성 성분과의 조합을 의미하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. The “composition” described in the present invention means a combination of the active ingredient with an inert ingredient such as a natural or artificial carrier, label or detector, or an adjuvant, diluent, binder, stabilizer, buffer, salt, lipophilic solvent, preservative, together with the K-ras specific activated T cells according to the present invention as an active ingredient, and includes a pharmaceutically acceptable carrier.

상기 담체는 약학적 부형제 및 부가적인 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물 (예를 들어, 단당류; 이당류; 삼당류; 사당류; 올리고당류; 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 설탕과 같은 설탕의 유도체, 폴리사카라이드, 또는 당 중합체 등)을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있으며, 1 내지 99.99 중량% 또는 부피%로 포함할 수 있다. The carrier may comprise pharmaceutical excipients and additional proteins, peptides, amino acids, lipids, and carbohydrates (e.g., monosaccharides; disaccharides; trisaccharides; tetrasaccharides; oligosaccharides; sugar derivatives such as alditols, aldonic acids, esterified sugars, polysaccharides, or sugar polymers), alone or in combination, and may comprise from 1 to 99.99 wt % or volume %.

단백질 부형제는 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 알부민, 젤라틴, 카제인 등을 포함할 수 있으며 이에 제한되지 않는다. Protein excipients may include, but are not limited to, human serum albumin, recombinant human albumin, gelatin, casein, and the like.

완충 역할을 할 수 있는 대표적인 아미노산 성분으로는 알라닌, 알기닌, 글리신, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 라이신, 루신, 아이소루신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파탐 등을 포함할 수 있으며 이에 제한되지 않는다. Representative amino acid components that can act as a buffer include, but are not limited to, alanine, arginine, glycine, betaine, histidine, glutamic acid, aspartic acid, cysteine, lysine, leucine, isoleucine, valine, methionine, phenylalanine, and aspartame.

탄수화물 부형제는 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 솔보스와 같은 단당류; 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스와 같은 이당류, 라피노스, 말토덱스트린, 텍스트란, 전분과 같은 다당류, 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 소르비톨, 및 마이오이노시톨과 같은 알디톨 등을 포함할 수 있으며 이에 제한되지 않는다. Carbohydrate excipients may include, but are not limited to, monosaccharides such as fructose, maltose, galactose, glucose, D-mannose, and sorbose; disaccharides such as lactose, sucrose, trehalose, and cellobiose; polysaccharides such as raffinose, maltodextrin, dextran, and starch; and alditols such as mannitol, xylitol, maltitol, lactitol, sorbitol, and myoinositol.

본 발명의 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하는 폐 선암종(lung adenocarcinoma)의 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 당업자에 의해 공지의 방법으로 제제화할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 필요에 따라서 물 또는 그 외의 약학적으로 허용되는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있으며 약학적으로 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리 식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당 조합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화함으로써 제제화 할 수 있다. 상기 제제화에 있어서 유효성분량은 지시받은 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있도록 하는 것을 의미한다. The pharmaceutical composition for the prevention and treatment of lung adenocarcinoma containing the K-ras specific activated T cell of the present invention can be formulated by a method known to those skilled in the art. The pharmaceutical composition of the present invention can be used parenterally in the form of an injection of a sterile solution or suspension with water or other pharmaceutically acceptable liquid, if necessary, and can be formulated by mixing it appropriately with a pharmaceutically acceptable carrier or medium, specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, excipient, vehicle, preservative, binder, etc., in the form of a unit dosage required for generally recognized pharmaceutical practice. In the above formulation, the active ingredient amount means such that an appropriate dosage within the indicated range can be obtained.

본 발명의 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하는 폐 선암종(lung adenocarcinoma)의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 주사를 위한 무균 조성물로서 제제화 하는 경우 주사용 증류수와 같은 부형액을 이용해 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수 있다. 주사용의 수용액으로서는 생리 식염수, 포도당 및 그 외의 보조약을 포함한 등장용액 예를 들어, D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화 나트륨을 사용할 수 있으며 적당한 용해 보조제 예를 들어, 에탄올류인 폴리 알코올, 프로필렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜과 비이온성 계면활성제류인 폴리소르베이트 80(TM), 및HCO-50을 병용하여 사용 할 수 있다. 또한 유성액으로서 참기름, 콩기름을 사용 할 수 있으며 용해 보조제로서 안식향산벤질, 벤질 알코올과 병용하여 사용 할 수 있다. When the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of lung adenocarcinoma containing the K-ras specific activated T cell of the present invention is formulated as a sterile composition for injection, it can be prescribed according to the usual formulation practice using an excipient such as distilled water for injection. As the aqueous solution for injection, an isotonic solution containing physiological saline, glucose and other auxiliary drugs, for example, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride can be used, and a suitable solubilizing agent, for example, polyalcohol, propylene glycol, and polyethylene glycol as ethanols, and polysorbate 80 (TM) and HCO-50 as nonionic surfactants can be used in combination. In addition, sesame oil and soybean oil can be used as an oily liquid, and benzyl benzoate and benzyl alcohol can be used in combination as a solubilizing agent.

상기 주사제형의 예로서는 정맥내 주사제형, 동맥내 주사제형, 선택적 동맥내 주사제형, 근육내 주사제형, 복강내 주사제형, 피하주사제형, 뇌실내 주사제형, 뇌내 주사제형, 골수액강내 주사제형이 있으며 바람직하게는 상기 주사제형은 정맥내 주사제형이다.Examples of the above injection types include intravenous injection types, intraarterial injection types, selective intraarterial injection types, intramuscular injection types, intraperitoneal injection types, subcutaneous injection types, intracerebroventricular injection types, intracerebral injection types, and intramedullary injection types, and preferably, the above injection type is an intravenous injection type.

본 발명의 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하는 폐 선암종(lung adenocarcinoma)의 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 약제학적 유효량의 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함한다. 상기 유효량의 결정은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 명세서에 개시된 내용을 기반으로 용이하게 결정될 수 있다. The pharmaceutical composition for the prevention and treatment of lung adenocarcinoma comprising K-ras specific activated T cells of the present invention comprises a pharmaceutically effective amount of K-ras specific activated T cells. The determination of the effective amount can be easily determined by a person skilled in the art based on the contents disclosed herein.

일반적으로 상기 약제학적 유효량은 유효성분을 낮은 농도로 1차 투여한 후, 대상체에서 부작용이 없으면서도 요망되는 효과 예를 들어, 암과 관련된 증상이 감소되거나 제거되는 효과를 얻을 때까지 점진적으로 증량시키는 방법으로 결정된다. 본 발명의 폐 선암종(lung adenocarcinoma)의 예방 및 치료용 약제학적 조성물의 적절한 투여량이나 투여 간격을 결정하는 방법은 Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman et al., eds., 11th Edition, McGraw-Hill 2005, 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th and 21st Editions, Gennaro and University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippencott Williams & Wilkins (2003 and 2005)에 상세히 설명되어 있다.In general, the pharmaceutically effective amount is determined by first administering the active ingredient at a low concentration and then gradually increasing the dose until the desired effect, for example, the effect of reducing or eliminating cancer-related symptoms, is obtained without side effects in the subject. Methods for determining the appropriate dosage or administration interval of the pharmaceutical composition for preventing and treating lung adenocarcinoma of the present invention are described in detail in Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman et al., eds., 11th Edition, McGraw-Hill 2005, and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th and 21st Editions, Gennaro and University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippencott Williams & Wilkins (2003 and 2005).

본 발명의 폐 선암종(lung adenocarcinoma)의 예방 및 치료용 약제학적 조성물의 투여 방법은 암의 종류, 환자의 나이, 체중, 성별, 의학적 상태, 질환의 중증도, 투여 경로, 및 별도로 투여되는 약물과 같은 다양한 인자를 고려하여 결정될 수 있다. 본 발명의 폐 선암종(lung adenocarcinoma)의 예방 및 치료용 약제학적 조성물이 환자에 투여되는 양은 투여 방법, 환자의 건강 상태, 체중, 의사의 처방과 같은 많은 인자에 의하여 결정될 수 있으며, 이는 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자의 지식 범위 내에 있다. The method of administration of the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of lung adenocarcinoma of the present invention can be determined by considering various factors such as the type of cancer, the patient's age, weight, sex, medical condition, severity of the disease, administration route, and separately administered drugs. The amount of the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of lung adenocarcinoma of the present invention administered to the patient can be determined by many factors such as the method of administration, the patient's health condition, weight, and the doctor's prescription, which is within the scope of knowledge of a person having ordinary skill in the art.

본 발명의 폐 선암종(lung adenocarcinoma)의 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 약 1x106cells/㎖ 이상, 약 2x106cells/㎖ 이상, 약 3x106cells/㎖ 이상, 약 4x106cells/㎖ 이상, 약 5x106cells/㎖ 이상, 약 6x106cells/㎖이상, 약 7x106cells/㎖ 이상, 약 8x106cells/㎖ 이상, 약 9x106cells/㎖ 이상, 약 1x107cells/㎖ 이상, 약 2x107cells/㎖ 이상, 약 3x107cells/㎖ 이상, 약 4x107cells/㎖ 이상, 약 5x107cells/㎖ 이상, 약 6x107cells/㎖ 이상, 약 7x107cells/㎖ 이상, 약 8x107cells/㎖ 이상, 약 9x107cells/㎖ 이상, 약 1x108cells/㎖ 이상, 약 2x108cells/㎖ 이상, 약 3x108cells/㎖ 이상, 약 4x108cells/㎖ 이상, 약 5x108cells/㎖ 이상, 약 6x108cells/㎖ 이상, 약 7x108cells/㎖ 이상, 약 8x108cells/㎖ 이상, 또는 약 9x108cells/㎖ 이상의 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 포함하나, 통상의 기술자는 동일한 효과를 얻기 위하여 변형 가능한 범위 내에서 조성물 내의 K-ras 특이적 활성화 T 세포의 농도를 조절할 수 있을 것이다.The pharmaceutical composition for preventing and treating lung adenocarcinoma of the present invention has an amount of about 1x10 6 cells/㎖ or more, about 2x10 6 cells/㎖ or more, about 3x10 6 cells/㎖ or more, about 4x10 6 cells/㎖ or more, about 5x10 6 cells/㎖ or more, about 6x10 6 cells/㎖ or more, about 7x10 6 cells/㎖ or more, about 8x10 6 cells/㎖ or more, about 9x10 6 cells/㎖ or more, about 1x10 7 cells/㎖ or more, about 2x10 7 cells/㎖ or more, about 3x10 7 cells/㎖ or more, about 4x10 7 cells/㎖ or more, about 5x10 7 cells/㎖ or more, about 6x10 7 cells/㎖ or more, about 7x10 7 cells/㎖ or more, about 8x10 7 cells/㎖ The composition comprises K-ras specific activated T cells at a concentration of at least about 9x10 7 cells/㎖, at least about 1x10 8 cells/㎖, at least about 2x10 8 cells/㎖, at least about 3x10 8 cells/㎖, at least about 4x10 8 cells/㎖, at least about 5x10 8 cells/㎖, at least about 6x10 8 cells/㎖, at least about 7x10 8 cells/㎖, at least about 8x10 8 cells/㎖, or at least about 9x10 8 cells/㎖, although one of ordinary skill in the art will be able to adjust the concentration of K-ras specific activated T cells in the composition within a variable range to obtain the same effect.

상기 “약”은 당해 기술 분야에서 통상적으로 관용되는 범위, 예를 들어, 평균 표준 편차 범위 내로 이해될 수 있으며 언급된 값의 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다.The above “about” can be understood as within a range commonly accepted in the art, for example, within the mean standard deviation range, and can be understood as within 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, or 0.01% of the stated value.

또한, 인산염 완충액, 및 초산나트륨 완충액과 같은 완충제, 염산 프로카인과 같은 무통화제, 벤질 알코올, 또는 페놀과 같은 안정제, 및 산화 방지제와 더 배합할 수 있다. 상기 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전시킨다. 현탁액 및 유탁액은, 담체로서, 천연 검, 한천, 알긴산 나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 또는 폴리비닐알코올을 함유할 수 있다. 근육 내 주사를 위한 현탁액 또는 용액은 활성 화합물과 함께, 약학적으로 허용되는 담체 예를 들어, 멸균수, 올리브 오일, 에틸 올레에이트, 글리콜류 및 적합한 양의 리도카인 염산염을 함유할 수 있다.In addition, it may further be combined with buffers such as phosphate buffer and sodium acetate buffer, an analgesic such as procaine hydrochloride, a stabilizer such as benzyl alcohol or phenol, and an antioxidant. The prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule. Suspensions and emulsions may contain natural gums, agar, sodium alginate, pectin, methylcellulose, carboxymethylcellulose, or polyvinyl alcohol as a carrier. Suspensions or solutions for intramuscular injection may contain the active compound together with a pharmaceutically acceptable carrier, for example, sterile water, olive oil, ethyl oleate, glycols, and a suitable amount of lidocaine hydrochloride.

본 발명의 폐 선암종(lung adenocarcinoma)의 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 정맥 주사 (bolus injection) 또는 연속주입 (continuous infusion)으로 환자에 투여될 수 있다. 본 발명의 폐 선암종(lung adenocarcinoma)의 예방 및 치료용 약제학적 조성물은 1시간 이하, 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 2주 이상, 3주 이상, 4주 이상, 1개월 이상, 3개월 이상, 6개월 이상에 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 또는 적어도 5회에 걸쳐, 연속적으로, 또는 일정 시간 간격으로, 또는 임상적 판단에 의하여 결정된 시간 간격을 두고 투여될 수 있다. The pharmaceutical composition for the prevention and treatment of lung adenocarcinoma of the present invention can be administered to a patient by bolus injection or continuous infusion. The pharmaceutical composition for the prevention and treatment of lung adenocarcinoma of the present invention can be administered at least once, at least twice, at least three times, at least four times, or at least five times, continuously, or at regular time intervals, or at time intervals determined by clinical judgment, over 1 hour or less, 1 hour or more, 2 hours or more, 3 hours or more, 4 hours or more, 8 hours or more, 12 hours or more, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 7 days or more, 2 weeks or more, 3 weeks or more, 4 weeks or more, 1 month or more, 3 months or more, 6 months or more.

주사제는 앰플형으로, 또는 복수회 투여 용기의 단위 용량형으로 제형화 될 수 있다. 그러나 통상의 기술자는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 환자의 나이, 체중, 키, 성별, 일반적 의학적 상태 및 기존 치료 이력과 같은 다양한 인자들에 따라 변경될 수 있음을 이해할 것이다.The injection may be formulated in ampoule form or in unit dose form in multiple dose containers. However, those skilled in the art will appreciate that the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on various factors such as the patient's age, weight, height, sex, general medical condition and previous treatment history.

본 발명은 상기 K-ras 특이적 활성화 T 세포는 K-ras 특이적 활성화 T 세포 유도용 항원 조성물과 1차 싸이토카인(cytokine)을 포함하는 배지에서 말초혈액단핵세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)를 배양하여 수지상 세포(dentritic cell)를 성숙시키는 동시에 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 유도하는 제 1 단계; 상기 배양된 PBMC에 2차 싸이토카인을 첨가하고 배양하여 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 더 유도하는 제 2 단계; 및 상기 2차 싸이토카인을 첨가하고 배양한 PBMC를 배양하여 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 증폭시킨 후 수득하는 제 3 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 K-ras 특이적 활성화 T 세포 유도용 항원 조성물을 이용한 K-ras 특이적 활성화 T 세포의 유도 방법으로 제조되는 것을 특징으로 한다.The present invention is characterized in that the K-ras-specific activated T cells are produced by a method for inducing K-ras-specific activated T cells using an antigen composition for inducing K-ras-specific activated T cells, the method comprising: a first step of culturing peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in a medium containing an antigen composition for inducing K-ras-specific activated T cells and a first cytokine to mature dentritic cells and simultaneously induce K-ras-specific activated T cells; a second step of adding a second cytokine to the cultured PBMCs and culturing them to further induce K-ras-specific activated T cells; and a third step of culturing the PBMCs, in which the second cytokine has been added, to amplify the K-ras-specific activated T cells and then obtain them.

본 발명의 K-ras 특이적 활성화 T 세포의 유도 방법은 Fast-IVS(in vitro stimulation)로서 종래의 IVS와 구분된다. 상기 IVS는 혈액에서 분리한 단핵구(monocyte)로부터 분화와 성숙(maturation) 과정을 통해 단핵구 유도 수지상 세포(monocyte-derived dendritic cell, moDC)를 수득한 후 본 발명의 K-ras 특이적 활성화 T 세포 유도용 항원 조성물을 처리한 환경에서 T 세포와 공배양(co-culture)하는 방법을 의미한다. 이에 반하여 본 발명의 Fast-IVS는 PBMC 내의 DC세포에 대하여 성숙과정과 항원(K-ras 특이적 활성화 T 세포 유도용 항원 조성물)처리를 동시에 수행하는 차이점이 있다. The method for inducing K-ras-specific activated T cells of the present invention is Fast-IVS (in vitro stimulation), which is distinguished from the conventional IVS. The IVS refers to a method of obtaining monocyte-derived dendritic cells (moDCs) through differentiation and maturation processes from monocytes separated from blood, and then co-culturing them with T cells in an environment treated with the antigen composition for inducing K-ras-specific activated T cells of the present invention. In contrast, the Fast-IVS of the present invention has a difference in that it performs the maturation process and antigen (antigen composition for inducing K-ras-specific activated T cells) treatment simultaneously on DC cells in PBMCs.

상기 T 세포 유도과정에서 항원으로 사용되는 K-ras 특이적 활성화 T 세포 유도용 항원 조성물은 DC 세포의 성숙 및 생장에 필요한 싸이토카인(cytokine), 호르몬 및 완충용액을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는 싸이토카인(cytokine)은 인터루킨-4(interleukin-4), 인터루킨-1β, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor, GM-CSF), 종양괴사인자-α(Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α)일 수 있으며 상기 호르몬은 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2, PGE2)일 수 있다. The antigen composition for inducing K-ras specific activated T cells used as an antigen in the above T cell induction process may further contain cytokines, hormones and buffer solutions necessary for the maturation and growth of DC cells. Preferably, the cytokines may be interleukin-4, interleukin-1β, Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (GM-CSF), Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), and the hormone may be prostaglandin E2 (PGE2).

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 인터루킨-4(Interleukin-4) 및 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor, GM-CSF)는 1차 싸이토카인으로서 PBMC내 단핵구(Monocyte)를 DC(Dendritic cell)로 분화 유도하는데 사용되었으며 상기 종양괴사인자-α(Tumor Necrosis Factor-α), 인터루킨-1β(Interleukin-1β), 및 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2)은 2차 싸이토카인으로서 미성숙DC(Immature DC)를 성숙시키기 위하여 사용 되었다.According to one embodiment of the present invention, Interleukin-4 and Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (GM-CSF) were used as primary cytokines to induce differentiation of monocytes in PBMCs into dendritic cells (DCs), and Tumor Necrosis Factor-α, Interleukin-1β, and Prostaglandin E2 were used as secondary cytokines to mature immature DCs.

본 발명의 다른 실시예에 따르면 상기 제 1 단계의 배양은 1 day 동안 수행하며, 상기 제 2 단계의 배양은 2 days 동안 수행하며, 상기 제 3 단계의 배양은 10 days 동안 수행하는 것을 특징으로 한다. 상기 단계별 배양 기간은 실시예를 통해 가장 효율적으로 K-ras 특이적 활성화 T 세포를 유도할 수 있는 방법으로 최적화 된 것이다.According to another embodiment of the present invention, the culturing of the first step is performed for 1 day, the culturing of the second step is performed for 2 days, and the culturing of the third step is performed for 10 days. The culturing periods for each step are optimized through the examples as a method capable of most efficiently inducing K-ras specific activated T cells.

본 발명은 K-ras 특이적 활성화 T 세포 유도용 항원 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 K-ras 돌연변이 재조합 중첩 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.The present invention is characterized in that the antigen composition for inducing K-ras specific activated T cells comprises, as an active ingredient, a K-ras mutant recombinant overlapping peptide consisting of the amino acid sequence of sequence number 1.

상기 서열번호 1은 189개의 아미노산으로 구성된 K-ras 단백질의 아미노산서열(서열번호 2)에서 유래한다. 상기 K-ras 돌연변이는 12번째 아미노산이 글리신(Glycine, G)에서 아스파르트산(Aspartic acid, D)으로 치환되었거나, 12번째 아미노산이 글리신(Glycine, G)에서 발린(Valine, V)으로 치환되었거나, 13번째 아미노산이 글리신(Glycine, G)에서 아스파르트산(Aspartic acid, D)으로 치환된 것을 의미한다.The above sequence number 1 is derived from the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the K-ras protein consisting of 189 amino acids. The above K-ras mutation means that the 12th amino acid is substituted from glycine (G) to aspartic acid (D), or the 12th amino acid is substituted from glycine (G) to valine (V), or the 13th amino acid is substituted from glycine (G) to aspartic acid (D).

상기 재조합(recombinant)은 디자인된 항원의 유전정보를 포함하는 재조합 플라스미드 DNA에 끼워 넣는 것을 의미하며 상기 재조합 플라스미드 DNA를 미생물에 형질전환시켜 단백질을 발현시키고 이를 정제하게 되면 본 발명의 K-ras 특이적 활성화 T 세포 유도용 항원이 수득된다. The above recombination means inserting the genetic information of the designed antigen into a recombinant plasmid DNA, and when the recombinant plasmid DNA is transformed into a microorganism to express the protein and purify it, the antigen for inducing K-ras specific activated T cells of the present invention is obtained.

본 발명의 K-ras 돌연변이 재조합 중첩 펩타이드는 서열번호 2로 이루어진 K-ras의 아미노산 서열에서 어느 하나의 아미노산으로부터 순차적으로 나열된 아미노산 서열을 단위로 하는 총 12 종류의 에피토프(epitope(n=1, 2, 3....10, 11, 12); 여기서 n은 에피토프의 순번을 의미하며 에피토프(n=1 내지 11)는 30개의 아미노산 서열을 포함하고 마지막 에프토프(n=12)는 23개의 아미노산 서열을 포함한다.)를 포함하되 에피토프(n=1)를 제외한 에피토프(n=2, 3,...12)는 N-terminal 방향 15개의 아미노산 서열이 직전 순번의 에피토프(n-1)의 C-terminal 방향 15개의 아미노산 서열과 서로 중첩되도록 디자인된다. The K-ras mutant recombinant overlapping peptide of the present invention comprises a total of 12 types of epitopes (epitopes (n=1, 2, 3....10, 11, 12); here, n represents the order of the epitopes, and the epitopes (n=1 to 11) include 30 amino acid sequences and the last epitope (n=12) includes 23 amino acid sequences) whose units are sequentially listed amino acid sequences from any one amino acid in the amino acid sequence of K-ras consisting of SEQ ID NO: 2, but the epitopes (n=2, 3,...12) excluding the epitope (n=1) are designed such that the 15 amino acid sequence in the N-terminal direction overlaps with the 15 amino acid sequence in the C-terminal direction of the epitope (n-1) of the immediately preceding order.

상기 K-ras 돌연변이 재조합 중첩 펩타이드는 상기 에피토프(n=1, 2, 3...10, 11, 12)가 순번에 따라 위치하며 상기 에피토프 사이는 LRMK-링커로 연결된 것을 특징으로 하며 상기 LRMK-링커는 루신(Leucine, L), 아르기닌(Arginine, R), 메티오닌(Methione, M), 라이신(Lysine, K)으로 구성된 링커로서 수지상세포에 의한 항원제시과정(MHC class I pathway)에 유리한 장점이 있다. The above K-ras mutant recombinant overlapping peptide is characterized in that the epitopes (n=1, 2, 3...10, 11, 12) are sequentially located and the epitopes are connected by an LRMK-linker. The LRMK-linker is a linker composed of Leucine (L), Arginine (R), Methionine (M), and Lysine (K), and has an advantage in the antigen presentation process (MHC class I pathway) by dendritic cells.

상세하게는 본 발명의 K-ras 특이적 활성화 T 세포 유도용 항원 조성물은 하기와 같이 디자인된다. 상기 에피토프(n=1)는 K-ras 돌연변이 G12V를 포함하며; 상기 에피토프(n=1)의 N-terminal에는 K-ras 돌연변이 G12D를 포함하는 에피토프(n=1)가 LRMK-링커로 더 연결되고; 상기 에피토프(n=12)의 C-terminal에는 K-ras 돌연변이 G13D을 포함하는 에피토프(n=1)가 LRMK-링커로 더 연결되며; 상기 K-ras 돌연변이 G13D을 포함하는 에피토프(n=1)의 C-terminal에는 K-ras 돌연변이가 포함되지 않은 에피토프(n=1)가 LRMK-링커로 더 연결된다.In detail, the antigen composition for inducing K-ras specific activated T cells of the present invention is designed as follows. The epitope (n=1) includes a K-ras mutation G12V; an epitope (n=1) including a K-ras mutation G12D is further linked to the N-terminal of the epitope (n=1) via an LRMK-linker; an epitope (n=1) including a K-ras mutation G13D is further linked to the C-terminal of the epitope (n=12) via an LRMK-linker; and an epitope (n=1) not including a K-ras mutation is further linked to the C-terminal of the epitope (n=1) including the K-ras mutation G13D via an LRMK-linker.

본 발명의 K-ras 특이적 활성화 T 세포 유도용 항원 조성물을 이용하면 K-ras 돌연변이(G12D, G12V, G13D)에 대해 특이적인 T 세포를 유도할 수 있으며 상기 K-ras 돌연변이(G12D, G12V, G13D)에 대해 특이적인 T 세포는 K-ras 돌연변이(G12D, G12V, G13D)를 가지는 암세포를 치료하는데 사용 가능하다. By using the antigen composition for inducing K-ras-specific activated T cells of the present invention, T cells specific for K-ras mutations (G12D, G12V, G13D) can be induced, and the T cells specific for the K-ras mutations (G12D, G12V, G13D) can be used to treat cancer cells having the K-ras mutations (G12D, G12V, G13D).

K-ras는 ras 단백질의 일종으로 세포의 분화, 증식 및 생존과 관련된 신호전달체계에서 중요한 역할을 하는 small GTPases 단백질이며 K-ras 단백질의 활성이 비정상적으로 증가하게 되면 암이 유발되는 것으로 알려져 있다. 상기 ras 단백질의 유전자인 KRAS는 여러 가지 암종에서 돌연변이로 발견되는 oncogene으로 잘 알려져 있으며 ras-유래 암종의 85%가 K-ras 돌연변이에 의한 것으로 알려져 있다. 따라서 암세포에 발현된 K-ras 및 그 돌연변이를 특이적으로 인식하는 T 세포를 증폭시키게 되면 K-ras의 활성이 비정상적으로 증가된 암을 효과적으로 제거하여 이를 치료 할 수 있게 된다. 상기 암은 K-ras 활성이 증가된 암이라면 제한되지 않으며 그 예로서 부신피질 암종(ACC), 방광요로상피 암종(BLCA), 유방 침습 암종(BRCA), 경부 편평 세포 암종 및 자궁경부내 선암종(CESC), 결장 선암종(COAD), 만성 림프성 백혈병(CLL), 대장암(CRC), 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 다형성아교모세포종(GBM), 두경부 편평 세포 암종(HNSC), 혐색소 신장(KICH), 신장 투명 세포 암종(KIRC), 신장 유두상 세포 암종(KIRP), 급성 골수성 백혈병(LAML), 간세포 암종(LIHC), 폐 선암종(LUAD), 폐 편평 세포 암종(LUSC), 다발성 골수종(MM), 난소 장액낭선암종(OV), 췌장 선암종(PAAD), 전립선 선암종(PRAD), 직장 선암종(READ), 피부 흑색종(SKCM), 위 선암종(STAD), 고환 생식 세포 종양(TGCT), 갑상선 선암종(THCA), 자궁체부 자궁내막 암종(UCEC) 또는 자궁 암육종(UCS)일 수 있다.K-ras is a type of ras protein and is a small GTPases protein that plays an important role in the signaling system related to cell differentiation, proliferation, and survival. It is known that cancer is induced when the activity of K-ras protein increases abnormally. KRAS, the gene for the ras protein, is well known as an oncogene found as a mutation in various cancers, and 85% of ras-derived cancers are known to be caused by K-ras mutations. Therefore, if T cells that specifically recognize K-ras and its mutations expressed in cancer cells are amplified, cancers in which the activity of K-ras is abnormally increased can be effectively removed and treated. The above cancers are not limited to cancers with increased K-ras activity, and examples thereof include adrenocortical carcinoma (ACC), urothelial carcinoma (BLCA), invasive breast carcinoma (BRCA), cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma (CESC), colon adenocarcinoma (COAD), chronic lymphocytic leukemia (CLL), colorectal cancer (CRC), diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), glioblastoma multiforme (GBM), head and neck squamous cell carcinoma (HNSC), chromophobe kidney (KICH), renal clear cell carcinoma (KIRC), renal papillary cell carcinoma (KIRP), acute myeloid leukemia (LAML), hepatocellular carcinoma (LIHC), lung adenocarcinoma (LUAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC), multiple myeloma (MM), ovarian serous cystadenocarcinoma (OV), pancreatic adenocarcinoma (PAAD), prostate adenocarcinoma (PRAD), rectal adenocarcinoma (READ), skin It may be melanoma (SKCM), gastric adenocarcinoma (STAD), testicular germ cell tumor (TGCT), thyroid adenocarcinoma (THCA), corpus endometrial carcinoma (UCEC), or uterine carcinosarcoma (UCS).

하기에서 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다.The present invention is described in detail below through examples.

실시예 Example

1. K-ras(WT)의 제조1. Production of K-ras(WT)

먼저 K-ras 아미노산 서열(서열번호 2)을 발현벡터에 삽입하였다. K-ras(WT)는 189개의 아미노산으로 이루어져 있으며 아미노산 서열은 하기 표 1과 같다.First, the K-ras amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) was inserted into the expression vector. K-ras (WT) consists of 189 amino acids, and the amino acid sequence is as shown in Table 1 below.

이름name 아미노산 서열(189aa)Amino acid sequence (189aa) K-ras(WT)K-ras(WT) MTEYKLVVVG10 AGGVGKSALT20 IQLIQNHFVD30 EYDPTIEDSY40

RKQVVIDGET50 CLLDILDTAG60 QEEYSAMRDQ70 YMRTGEGFLC80

VFAINNTKSF90 EDIHHYREQI100 KRVKDSEDVP110 MVLVGNKCDL120

PSRTVDTKQA130 QDLARSYGIP140 FIETSAKTRQ150 RVEDAFYTLV160

REIRQYRLKK170 ISKEEKTPGC180 VKIKKCIIM189

MTEYKLVVVG 10 AGGVGKSALT 20 IQLIQNHFVD 30 EYDPTIEDSY 40

RKQVVIDGET 50 CLLDILDTAG 60 QEEYSAMRDQ 70 YMRTGEGFLC 80

VFAINNTKSF 90 EDIHHYREQI 100 KRVKDSEDVP 110 MVLVGNKCDL 120

PSRTVDTKQA 130 QDLARSYGIP 140 FIETSAKTRQ 150 RVEDAFYTLV 160

REIRQYRLKK 170 ISKEEKTPGC 180 VKIKKCIIM 189

상기 K-ras-WT를 제한효소로 처리한 후 pET30a 벡터에 넣어 발현벡터를 제조 하였으며 상기 발현벡터는 E.coli에 형질전환하여 단백질을 발현시켰다. The above K-ras-WT was treated with a restriction enzyme and inserted into the pET30a vector to produce an expression vector, which was then transformed into E. coli to express the protein.

2. K-ras(M)-ROP의 제조2. Manufacturing of K-ras(M)-ROP

K-ras Mutant Recombinant Overlapping Peptide(K-ras(M)-ROP)의 항원을 디자인하고 K-ras(WT)와 동일한 방법으로 발현벡터를 제조하였다. 상기 K-ras(M)-ROP은 K-ras 아미노산 12번째 위치의 G(Glycine)가 D(Asapartic acid)로 변이한 G12D, K-ras 아미노산 12번째 위치의 G(Glycine)가 V(Valine)로 변이한 G12V, 또는 K-ras 아미노산 13번째 위치의 G(Glycine)가 D(Asapartic acid)로 변이한 G13D를 포함한다. The antigen of K-ras Mutant Recombinant Overlapping Peptide (K-ras(M)-ROP) was designed and an expression vector was prepared in the same manner as K-ras(WT). The K-ras(M)-ROP includes G12D, in which G(Glycine) at the 12th position of the K-ras amino acid is mutated to D(Asapartic acid), G12V, in which G(Glycine) at the 12th position of the K-ras amino acid is mutated to V(Valine), or G13D, in which G(Glycine) at the 13th position of the K-ras amino acid is mutated to D(Asapartic acid).

상기 K-ras(M)-ROP은 500개의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하며 아미노산이 순차적으로 30개씩 구분되되 하나의 에피토프(epitope)는 15개의 아미노산 서열이 서로 중복되도록 디자인되었다. 표 2는 K-ras(M)-ROP의 아미노산 서열(서열번호 1) 및 K-ras(M)-ROP 에피토프의 아미노산 서열을 보여준다. The above K-ras(M)-ROP is characterized by having a 500 amino acid sequence, and the amino acids are sequentially divided into groups of 30, but each epitope is designed so that 15 amino acid sequences overlap each other. Table 2 shows the amino acid sequence of K-ras(M)-ROP (SEQ ID NO: 1) and the amino acid sequence of the K-ras(M)-ROP epitope.

도 1은 본 발명의 K-ras(M)-ROP의 에피토프 구조를 보여준다.Figure 1 shows the epitope structure of K-ras(M)-ROP of the present invention.

이름name 아미노산 서열(500aa)Amino acid sequence (500aa) K-ras(M)-ROPK-ras(M)-ROP MTEYKLVVVG10 ADGVGKSALT20 IQLIQNHFVD30 LRMK 34
MTEYKLVVVG44 AVGVGKSALT54 IQLIQNHFVD64 LRMK 68
KSALTIQLIQ78 NHFVDEYDPT88 IEDSYRKQVV98 LRMK 102
EYDPTIEDSY112 RKQVVIDGET122 CLLDILDTAG132 LRMK 136
IDGETCLLDI146 LDTAGQEEYS156 AMRDQYMRTG166 LRMK 170
QEEYSAMRDQ180 YMRTGEGFLC190 VFAINNTKSF200 LRMK 204
EGFLCVFAIN214 NTKSFEDIHH224 YREQIKRVKD234 LRMK 238
EDIHHYREQI248 KRVKDSEDVP258 MVLVGNKCDL268 LRMK 272
SEDVPMVLVG282 NKCDLPSRTV292 DTKQAQDLAR302 LRMK 306
PSRTVDTKQA316 QDLARSYGIP326 FIETSAKTRQ336 LRMK 340
SYGIPFIETS350 AKTRQRVEDA360 FYTLVREIRQ370 LRMK 374
RVEDAFYTLV384 REIRQYRLKK394 ISKEEKTPGC404 LRMK 408
YRLKKISKEE418 KTPGCVKIKK428 CIIM432 LRMK 436
MTEYKLVVVG446 AGDVGKSALT456 IQLIQNHFVD466 LRMK 470
MTEYKLVVVG480 AGGVGKSALT490 IQLIQNHFVD500 MTEYKLVVVG 10 A D GVGKSALT 20 IQLIQNHFVD 30 LRMK 34
MTEYKLVVVG 44 A V GVGKSALT 54 IQLIQNHFVD 64 LRMK 68
KSALTIQLIQ 78 NHFVDEYDPT 88 IEDSYRKQVV 98 LRMK 102
EYDPTIEDSY 112 RKQVVIDGET 122 CLLDILDTAG 132 LRMK 136
IDGETCLLDI 146 LDTAGQEEYS 156 AMRDQYMRTG 166 LRMK 170
QEEYSAMRDQ 180 YMRTGEGGFLC 190 VFAINNTKSF 200 LRMK 204
EGFLCVFAIN 214 NTKSFEDIHH 224 YREQIKRVKD 234 LRMK 238
EDIHHYREQI 248 KRVKDSEDVP 258 MVLVGNKCDL 268 LRMK 272
SEDVPMVLVG 282 NKCDLPSRTV 292 DTKQAQDLAR 302 LRMK 306
PSRTVDTKQA 316 QDLARSYGIP 326 FIETSAKTRQ 336 LRMK 340
SYGIPFIETS 350 AKTRQRVEDA 360 FYTLVREIRQ 370 LRMK 374
RVEDAFYTLV 384 REIRQYRLKK 394 ISKEEKTPGC 404 LRMK 408
YRLKKISKEE 418 KTPGCVKIKK 428 CIIM 432 LRMK 436
MTEYKLVVVG 446 AG D VGKSALT 456 IQLIQNHFVD 466 LRMK 470
MTEYKLVVVG 480 AGGVGKSALT 490 IQLIQNHFVD 500 에피토프 이름Epitope name 아미노산 서열
(서열번호는 K-rasWT을 기준으로 부여하였음) Amino acid sequence
(The sequence number is assigned based on K-rasWT) 에피토프1(E1, n=1)Epitope 1 (E1, n=1) MTEYKLVVVG10 AGGVGKSALT20 IQLIQNHFVD30 MTEYKLVVVG 10 AGGVGKSALT 20 IQLIQNHFVD 30 에피토프2(E2, n=2)Epitope 2 (E2, n=2) KSALT20 IQLIQNHFVD30 EYDPTIEDSY40 RKQVV45 KSALT 20 IQLIQNHFVD 30 EYDPTIEDSY 40 RKQVV 45 에피토프3(E3, n=3)Epitope 3 (E3, n=3) EYDPTIEDSY40 RKQVVIDGET50 CLLDILDTAG60 EYDPTIEDSY 40 RKQVVIDGET 50 CLLDILDTAG 60 에피토프4(E4, n=4)Epitope 4 (E4, n=4) IDGET50 CLLDILDTAG60 QEEYSAMRDQ70 YMRTG75 IDGET 50 CLLDILDTAG 60 QEEYSAMRDQ 70 YMRTG 75 에피토프5(E5, n=5)Epitope 5 (E5, n=5) QEEYSAMRDQ70 YMRTGEGFLC80 VFAINNTKSF90 QEEYSAMRDQ 70 YMRTGEGGFLC 80 VFAINNTKSF 90 에피토프6(E6, n=6)Epitope 6 (E6, n=6) EGFLC80 VFAINNTKSF90 EDIHHYREQI100 KRVKD105 EGFLC 80 VFAINNTKSF 90 EDIHHYREQI 100 KRVKD 105 에피토프7(E7, n=7)Epitope 7 (E7, n=7) EDIHHYREQI100 KRVKDSEDVP110 MVLVGNKCDL120 EDIHHYREQI 100 KRVKDSEDVP 110 MVLVGNKCDL 120 에피토프8(E8, n=8)Epitope 8 (E8, n=8) SEDVP110 MVLVGNKCDL120 PSRTVDTKQA130 QDLAR135 SEDVP 110 MVLVGNKCDL 120 PSRTVDTKQA 130 QDLAR 135 에피토프9(E9, n=8)Epitope 9 (E9, n=8) PSRTVDTKQA130 QDLARSYGIP140 FIETSAKTRQ150 PSRTVDTKQA 130 QDLARSYGIP 140 FIETSAKTRQ 150 에피토프10(E10, n=10)Epitope 10 (E10, n=10) SYGIP140 FIETSAKTRQ150 RVEDAFYTLV160 REIRQ165 SYGIP 140 FIETSAKTRQ 150 RVEDAFYTLV 160 REIRQ 165 에피토프11(E11, n=11)Epitope 11 (E11, n=11) RVEDAFYTLV160 REIRQYRLKK170 ISKEEKTPGC180 RVEDAFYTLV 160 REIRQYRLKK 170 ISKEEKTPGC 180 에피토프12(E12, n=12)Epitope 12 (E12, n=12) YRLKK170 ISKEEKTPGC180 VKIKKCIIM189 YRLKK 170 ISKEEKTPGC 180 VKIKKCIIM 189 에피토프1-G12D(E1-G12D)Epitope 1-G12D (E1-G12D) MTEYKLVVVG10 ADGVGKSALT20 IQLIQNHFVD30 MTEYKLVVVG 10 A D GVGKSALT 20 IQLIQNHFVD 30 에피토프1-G12V(E1-G12V)Epitope 1-G12V (E1-G12V) MTEYKLVVVG10 AVGVGKSALT20 IQLIQNHFVD30 MTEYKLVVVG 10 A V GVGKSALT 20 IQLIQNHFVD 30 에피토프1-G13D(E1-G13D)Epitope 1-G13D (E1-G13D) MTEYKLVVVG10 AGDVGKSALT20 IQLIQNHFVD30 MTEYKLVVVG 10 AG D VGKSALT 20 IQLIQNHFVD 30

상기 K-ras(M)-ROP은 합성한 후(Genescript Co. Ltd.) pET30a 벡터에 클로닝(cloning)하였으며 E.coli에 형질전환하여 발현시켰다. 발현된 단백질은 APC(Activated protein C)를 이용하여 절단하는 방법으로 K-ras(M)-ROP을 제조하였다. The above K-ras(M)-ROP was synthesized (Genescript Co. Ltd.) and cloned into the pET30a vector, transformed into E. coli, and expressed. The expressed protein was cleaved using APC (Activated protein C) to produce K-ras(M)-ROP.

3. K-ras(M)-ROP 반응성 스크리닝 분석3. K-ras(M)-ROP reactivity screening analysis

정상인의 말초 혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서 K-ras(M)-ROP의 반응성을 스크리닝 하였다. 상기 스크리닝은 고착화효소항체법(enzyme-linked immune absorbent spot assay, ELISpot assay)을 이용하였다. The reactivity of K-ras(M)-ROP was screened in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from normal individuals. The screening was performed using an enzyme-linked immune absorbent spot assay (ELISpot assay).

도 2는 본 발명의 K-ras(M)-ROP에 대한 PBMC의 반응성을 분석한 결과를 보여준다. 패널 A는 ELISpot(IFN-γ) assay의 SFC 이미지를 보여주며 패널 B는 ELISpot(IFN-γ) assay의 SFC 그래프를 보여준다. Figure 2 shows the results of analyzing the reactivity of PBMC to K-ras(M)-ROP of the present invention. Panel A shows the SFC image of the ELISpot(IFN-γ) assay, and Panel B shows the SFC graph of the ELISpot(IFN-γ) assay.

먼저 정상인 자원자의 백혈구 분반술에서 얻어진 PBMC(LP-1 PBMC, LP-4 PBMC, 및 LP-6 PBMC) 1x105cell을 파종(seeding)하여 세포배양한 후 항원을 처리하였다. 상기 항원으로 K-ras(M)-ROP 5㎍/㎖, 1.0㎍/㎖, 0.1㎍/㎖을 사용하였으며 양성대조군(positive control)로서 anti-CD3을 사용하였다. 세포배양은 37℃, CO2 5%, overnight(O/N)의 조건으로 수행하였으며 배양한 세포는 IFN-γ로 염색하여 SFC(Spot Forming Cell)를 읽어 분석하였다. 실험결과 정상인 PBMC중 LP-1에서 K-ras(M)-ROP에 대한 반응성이 가장 우수한 것으로 확인되었다. First, 1x105 cells of PBMC (LP-1 PBMC, LP-4 PBMC, and LP-6 PBMC) obtained from leukocyte apheresis of normal volunteers were seeded and cultured, and then treated with antigen. K-ras(M)-ROP 5㎍/㎖, 1.0㎍/㎖, and 0.1㎍/㎖ were used as the antigen, and anti-CD3 was used as a positive control. Cell culture was performed under the conditions of 37℃, CO2 5%, overnight (O/N), and the cultured cells were stained with IFN-γ and analyzed by reading SFC (Spot Forming Cell). As a result of the experiment, it was confirmed that the reactivity to K-ras(M)-ROP was the best in LP-1 among normal PBMCs.

4. K-ras(M)-ROP 농도별 특이적 CD3+ T 세포 비율 분석4. Analysis of specific CD3+ T cell ratio by K-ras(M)-ROP concentration

상기 LP-1 PBMC에 대하여 K-ras(M)-ROP 농도에 따른 K-ras(M)-ROP 특이적 CD3+ T세포 비율을 분석하였다. 이를 위하여 LP-1 PBMC에 항원을 처리한 후 IFN-γ capture staining을 수행하고 이를 분석하였다. The K-ras(M)-ROP-specific CD3+ T cell ratio according to the K-ras(M)-ROP concentration was analyzed for the above LP-1 PBMC. To this end, LP-1 PBMC was treated with antigen, and then IFN-γ capture staining was performed and analyzed.

도 3은 본 발명의 K-ras(M)-ROP 농도에 따른 LP-1 PBMC의 K-ras(M)-ROP 특이적 CD3+ T 세포 비율을 분석한 결과를 보여준다. 패널 A는 ELISpot(IFN-γ) assay의 조건별 SFC 이미지를 보여주며 패널 B는 ELISpot(IFN-γ) assay의 조건별 SFC 그래프를 보여준다. 패널 C는 IFN-γ capture staining의 원리 빛 방법을 보여주며 패널 D는 IFN-γ capture FACS 분석결과를 보여준다. 패널 E는 IFN-γ 분비 CD3+ T 세포 비율(%) 그래프를 보여준다.Figure 3 shows the results of analyzing the K-ras(M)-ROP-specific CD3+ T cell ratio of LP-1 PBMC according to the K-ras(M)-ROP concentration of the present invention. Panel A shows the SFC image of the ELISpot(IFN-γ) assay according to the conditions, and panel B shows the SFC graph of the ELISpot(IFN-γ) assay according to the conditions. Panel C shows the principle and method of IFN-γ capture staining, and panel D shows the result of IFN-γ capture FACS analysis. Panel E shows a graph of the ratio (%) of IFN-γ secreting CD3+ T cells.

먼저 LP-1 PBMC 1x106cell을 파종(seeding)하여 세포배양한 후 농도를 달리하여 항원(K-ras(M)-ROP 5㎍/㎖, K-ras(M)-ROP 1.0㎍/㎖, K-ras(M)-ROP 0.1㎍/㎖)을 처리하였다. 또한 파상풍 백신(Tetanus toxoid vaccine, TTX)을 5㎍/㎖, 1.0㎍/㎖으로 처리한 LP-1 PBMC과 anti-CD3를 양성대조군(positive control)으로 사용하였다. 세포배양은 37℃, CO2 5%, overnight(O/N)의 조건으로 수행하였다. First, LP-1 PBMC 1x10 6 cells were seeded and cultured, and then treated with antigens at different concentrations (K-ras(M)-ROP 5 ㎍/㎖, K-ras(M)-ROP 1.0 ㎍/㎖, K-ras(M)-ROP 0.1 ㎍/㎖). In addition, LP-1 PBMC treated with 5 ㎍/㎖ and 1.0 ㎍/㎖ of tetanus toxoid vaccine (TTX) and anti-CD3 were used as positive controls. Cell culture was performed at 37℃, CO2 5%, overnight (O/N).

IFN-γ capture staining은 항원이 처리된 LP-1 PBMC에 1차 포획 항체(1st capture antibody)를 처리한 후 37℃에서 45분간 배양하고 2차 검출 항체(2nd detection andtibody)와 CD3, CD4, CD8, 및 CD137을 처리하는 방법으로 수행하였다. 상기 IFN-γ capture staining이 수행된 LP-1 PBMC는 세포자동해석분리장치(Fluorescence activated cell sorter, FACS)를 이용하여 세포특성을 분석하였다.IFN-γ capture staining was performed by treating LP-1 PBMCs treated with the 1st capture antibody, incubating at 37℃ for 45 minutes, and then treating with 2nd detection antibodies and CD3, CD4, CD8, and CD137. LP-1 PBMCs subjected to the IFN-γ capture staining were analyzed for their cell characteristics using a fluorescence activated cell sorter (FACS).

실험결과 LP-1 PBMC에 농도에 따라 항원을 처리하게 되면 K-ras(M)-ROP 특이적 CD2+ T 세포 비율이 증가하는 것이 확인되었으며 이는 상기 ELISpot(IFN-γ) 결과와 잘 일치하였다. 따라서 LP-1 PBMC의 반응성은 K-ras(M)-ROP에 농도 의존적으로 증가하는 것으로 판단된다. 또한 LP-1 PBMC에 K-ras(M)-ROP에 대한 반응성을 정량적으로 평가한 결과 K-ras(M)-ROP 5㎍/㎖을 처리하는 경우 K-ras(M)-ROP 특이 CD3+ T 세포의 비율이 2.4% 수준인 것으로 확인되었다.As a result of the experiment, it was confirmed that when LP-1 PBMCs were treated with antigens according to their concentration, the proportion of K-ras(M)-ROP-specific CD2+ T cells increased, which was well consistent with the above ELISpot (IFN-γ) results. Therefore, it is judged that the reactivity of LP-1 PBMCs increases in a concentration-dependent manner to K-ras(M)-ROP. In addition, as a result of quantitatively evaluating the reactivity of LP-1 PBMCs to K-ras(M)-ROP, it was confirmed that the proportion of K-ras(M)-ROP-specific CD3+ T cells was about 2.4% when 5㎍/㎖ of K-ras(M)-ROP was treated.

5. 항원의 종류에 따른 항원 특이적 CD3+ T 세포 비율 비교 분석5. Comparative analysis of antigen-specific CD3+ T cell ratios by antigen type

LP-1 PBMC에 K-ras(M)-ROP(500aa), K-ras1-24Wild-type(Peptide Wt, 24aa), 또는 K-ras1-24돌연변이(24aa)를 처리 한 후 항원 특이적 CD3+ T 세포 비율을 비교 분석하였다. After treating LP-1 PBMCs with K-ras(M)-ROP(500aa), K-ras 1-24 Wild-type (Peptide Wt, 24aa), or K-ras 1-24 mutant (24aa), the proportion of antigen-specific CD3+ T cells was compared and analyzed.

도 4는 본 발명의 K-ras(M)-ROP, K-ras1-24Wild-type, 및 K-ras1-24돌연변이에 대한 LP-1 PBMC의 항원 특이적 CD3+ T-세포 비율을 분석한 결과를 보여준다. 패널 A는 K-ras(M)-ROP, K-ras1-24Wild-type, 및 K-ras1-24돌연변이가 처리된 LP-1 PBMC의 IFN-γ capture FACS 분석결과를 보여준다. 패널 B는 IFN-γ 분비 CD3+ T 세포 비율(%) 그래프를 보여주며, 패널 C는 항원 특이 CD3+ T 세포 비율(%) 그래프를 표로 정리한 결과를 보여준다. No Ag는 실행기(effector)만을 사용한 것을 의미하며, @CD3는 양성대조군(positive control)로서 anti-CD3를 사용한 것을 의미한다.Figure 4 shows the results of analyzing the antigen-specific CD3+ T-cell ratio of LP-1 PBMC for K-ras(M)-ROP, K-ras 1-24 Wild-type, and K-ras 1-24 mutant of the present invention. Panel A shows the results of IFN-γ capture FACS analysis of LP-1 PBMC treated with K-ras(M)-ROP, K-ras 1-24 Wild-type, and K-ras 1-24 mutant. Panel B shows a graph of the percentage of IFN-γ secreting CD3+ T cells, and Panel C shows a table summarizing the graph of the percentage of antigen-specific CD3+ T cells. No Ag means that only the effector was used, and @CD3 means that anti-CD3 was used as a positive control.

상기 K-ras1-24돌연변이는 K-ras1-24Wild-type에서 12번째 아미노산인 G가 D, 또는 V로 치환되거나 12번째 아미노산인 G가 D된 것(Pep.G12D, Pep.G12V, Pep.G13D)을 의미한다. 항원 특이적 CD3+ T-세포 비율은 상기와 동일한 방법으로 분석하였으며 항원으로 K-ras(M)-ROP(500aa), Peptide Wt, Pep.G12D, Pep.G12V, 및 Pep.G13D를 사용하였다. The above K-ras 1-24 mutations refer to the 12th amino acid G being substituted with D or V in K-ras 1-24 Wild-type, or the 12th amino acid G being replaced with D (Pep.G12D, Pep.G12V, Pep.G13D). The antigen-specific CD3+ T-cell ratio was analyzed using the same method as above, and K-ras(M)-ROP (500aa), Peptide Wt, Pep.G12D, Pep.G12V, and Pep.G13D were used as antigens.

실험결과 Peptide Wt에 반응한 CD+ T세포는 확인되지 않았으며 Pep.G12D, Pep.G12V, 및 Pep.G13D에 반응한 CD3+ T 세포 역시 0.31%(Pep.G12D), 0.11%(Pep.G12V) 및 0.25%(Pep.G13D)로 현저히 낮은 것을 확인되었다. 상기 결과는 K-ras(M)-ROP에 반응하여 유도된 CD3+ T 세포의 비율이 2.41%임을 감안할 때 24개의 아미노산으로 구성된 펩타이드인 에피토프만으로는 항원 특이 CD3+ T 세포의 유도가 미미하다는 것을 의미한다. As a result of the experiment, CD+ T cells that reacted with peptide Wt were not confirmed, and CD3+ T cells that reacted with Pep.G12D, Pep.G12V, and Pep.G13D were also significantly low at 0.31% (Pep.G12D), 0.11% (Pep.G12V), and 0.25% (Pep.G13D). Considering that the ratio of CD3+ T cells induced in response to K-ras(M)-ROP was 2.41%, the above results imply that the induction of antigen-specific CD3+ T cells is minimal with only an epitope consisting of a peptide composed of 24 amino acids.

6. K-ras(M)-ROP 및 Fast-IVS를 이용한 ROP-T 세포의 제조6. Production of ROP-T cells using K-ras(M)-ROP and Fast-IVS

상기 실험결과를 바탕으로 K-ras(M)-ROP에 반응하는 CD3+ T 세포(ROP-T 세포)를 제조하였다. 본 발명에서는 Fast-IVS(Fast-In vitro Stimulation)을 적용하여 ROP-T 세포를 제조하였다. Based on the above experimental results, CD3+ T cells (ROP-T cells) that react with K-ras(M)-ROP were produced. In the present invention, ROP-T cells were produced by applying Fast-IVS (Fast-In vitro Stimulation).

도 5는 본 발명의 Fast-IVS 공정과 No-Cytokine 공정을 비교한 결과를 보여준다. 패널 A는 Fast-IVS를 이용한 ROP-T 세포의 제조공정 및 평가 과정 및 ROP-T 세포의 특성 분석 과정을 보여준다. 패널 B는 Fast-IVS 공정 조건과 No-Cytokine 공정 조건에서 증폭된 T 세포의 IFN-γ+ CD3+ T 세포 비율을 비교한 결과를 보여준다.Figure 5 shows the results of comparing the Fast-IVS process and the No-Cytokine process of the present invention. Panel A shows the manufacturing process and evaluation process of ROP-T cells using Fast-IVS and the characteristic analysis process of ROP-T cells. Panel B shows the results of comparing the IFN-γ+ CD3+ T cell ratios of T cells amplified under Fast-IVS process conditions and No-Cytokine process conditions.

상기 Fast-IVS 공정은 항원을 이용하여 항원 특이적 CD3+ T 세포를 유도하는 것과 싸이토카인을 처리하여 세포 증폭(Cell Expansion)을 수행하는 공정을 동시에 수행하는 것을 특징으로 한다. 이에 반하여 상기 No-Cytokine 공정은 항원에 의해 유도된 항원 특이적 CD3+ T 세포에 대하여 싸이토카인을 처리하지 않고 세포 증폭을 수행하는 것을 특징으로 한다. The above Fast-IVS process is characterized by simultaneously performing the processes of inducing antigen-specific CD3+ T cells using an antigen and performing cell expansion by treating cytokines. In contrast, the No-Cytokine process is characterized by performing cell expansion on antigen-specific CD3+ T cells induced by the antigen without treating them with cytokines.

상기 Fast-IVS 공정의 세포 증폭에 사용한 싸이토카인(cytokine)은 인터루킨-4(Interleukin-4, IL-4), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor, GM-CSF), 종양괴사인자-α(Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α), 인터루킨-1b(Interleukin-1β, IL-1β) 및 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2, PGE2)이다. The cytokines used for cell amplification in the above Fast-IVS process are Interleukin-4 (IL-4), Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (GM-CSF), Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), Interleukin-1β (IL-1β), and Prostaglandin E2 (PGE2).

하기 표 3은 본 발명의 Fast-IVS 공정과 No-Cytokine 공정을 보여준다.Table 3 below shows the Fast-IVS process and the No-Cytokine process of the present invention.

Fast-IVS 공정Fast-IVS process No-Cytokine 공정 No-Cytokine Process Day-0Day-0 LP-1 PBMC Seeding with Ag, IL-4, and GM-CSFLP-1 PBMC Seeding with Ag, IL-4, and GM-CSF LP-1 PBMC Seeding Without CytokineLP-1 PBMC Seeding Without Cytokine Day-1Day-1 Adding TNF-α, IL-1β and PGE2Adding TNF-α, IL-1β and PGE2 No Cytokine AddingNo Cytokine Adding Day 3Day 3 ExpansionExpansion ExpansionExpansion Day 5, 7, 9, 11, 12Day 5, 7, 9, 11, 12 Media AddingMedia Adding Media AddingMedia Adding Day 13Day 13 HarvestHarvest HarvestHarvest

분석결과 Fast-IVS 공정에서 No-Cytokine 공정보다 IFN-γ를 분비하는 항원 특이적 CD3+ T 세포 비율이 4배가량 더 많이 증폭된 것이 확인되었다.The analysis results confirmed that the proportion of antigen-specific CD3+ T cells secreting IFN-γ was amplified approximately four times more in the Fast-IVS process than in the No-Cytokine process.

7. ROP-T 세포 제조용 Fast-IVS 공정의 최적화7. Optimization of Fast-IVS process for ROP-T cell production

K-ras(M)-ROP의 처리 농도 및 Fast-IVS 공정조건을 변경하여 ROP-T 세포 제조용 Fast-IVS 공정을 최적화하였다. 하기 표 4는 Fast-IVS 공정의 최적화를 위한 실시예를 보여준다.The Fast-IVS process for ROP-T cell production was optimized by changing the treatment concentration of K-ras(M)-ROP and the Fast-IVS process conditions. Table 4 below shows examples for optimization of the Fast-IVS process.

실시예1Example 1 실시예2Example 2 실시예3Example 3 실험조건 Experimental conditions ScaleScale PBMCsPBMCs 10M@24well10M@24well 10M@24well10M@24well 10M@24well10M@24well CytokineCytokine 제조사manufacturing company JW CreageneJW Creagene JW CreageneJW Creagene JW CreageneJW Creagene K-ras(M)-ROPK-ras(M)-ROP ㎍/㎖ ㎍/㎖ 5.05.0 1.01.0 1.01.0 Fast-IVS(배지 AIM-V) 기간Fast-IVS (Badge AIM-V) period DaysDays 55 55 77 Expansion 기간 Expansion period DaysDays 1010 1010 1010 실험결과Experimental Results Expansion FoldExpansion Fold No Ag-TNo Ag-T 4545 3434 5555 ROP-TROP-T 5555 4949 6565 Helper T cellHelper T cell No Ag-TNo Ag-T 54.754.7 35.835.8 21.121.1 ROP-TROP-T 64.464.4 75.375.3 60.460.4 K-ras(M)-ROP specific T cell(IFN-γ+, CD3+)(%)K-ras(M)-ROP specific T cell(IFN-γ+, CD3+)(%) No Ag-TNo Ag-T 4.64.6 1.11.1 1.21.2 ROP-TROP-T 19.719.7 18.618.6 52.952.9

실험결과 모든 실시예에서 ROP-T 세포가 증폭된 것이 확인되었으며 최적의 Fast-IVS 공정은 K-ras(M)-ROP의 처리 농도 1.0㎍/㎖ 및 Fast-IVS 기간 7일 인 것으로 확인되었다.The experimental results confirmed that ROP-T cells were amplified in all examples, and the optimal Fast-IVS process was confirmed to be a treatment concentration of 1.0 μg/㎖ of K-ras(M)-ROP and a Fast-IVS period of 7 days.

8. ROP-T 세포 특성 분석8. Analysis of ROP-T cell characteristics

K-ras 돌연변이 에피토프(epitope) 스크리닝을 수행하여 증폭된 ROP-T 세포의 특성을 분석하였다. 이를 위하여 PBMC로부터 자가 수지상세포(Autologous Dendritic Cell)를 유도하고 상기 자가 수지상세포에 항원을 감작시켜 항원 특이적인 T 세포를 자극할 수 있는 항원 감작수지상 세포(Antigen pulsed Dendritic Cell, Ag pulsed DC)를 제조하여 ROP-T 세포의 반응성을 확인하였다. 상기 반응성은 재자극 IFN-γ 분비 T 세포 비율(Re-stimulation IFN-γ secretion T frequency)(%)을 산출하여 분석하였다. The characteristics of amplified ROP-T cells were analyzed by performing K-ras mutant epitope screening. To this end, autologous dendritic cells (ADCs) were induced from PBMCs, and antigen-sensitized ADCs were prepared to stimulate antigen-specific T cells, thereby confirming the reactivity of ROP-T cells. The reactivity was analyzed by calculating the re-stimulation IFN-γ secretion T frequency (%).

도 6은 본 발명의 ROP-T 세포에 대한 K-ras 돌연변이 에피토프 스크리닝 결과를 보여준다. 패널 A는 IFN-γ+, CD3+, CD4+에 대한 FACS 분석결과를 보여준다. 패널 B는 조건 별 재자극 IFN-γ 분비 T 세포 비율의 세포 비율(%)을 분석한 결과를 보여준다. Figure 6 shows the results of K-ras mutant epitope screening for ROP-T cells of the present invention. Panel A shows the results of FACS analysis for IFN-γ+, CD3+, and CD4+. Panel B shows the results of analyzing the cell ratio (%) of the conditionally restimulated IFN-γ secreting T cell ratio.

먼저 자가 수지상세포(Autologous DC)를 4일간 배양하고 항원에 감작시켜 Ag pulsed DC를 준비하였다. 상기 Ag pulsed DC는 96well에 5x103cells/100㎕으로 분주하였다. K-ras(M)-ROP 특이 CD3+ T 세포를 상기 96well에 1x105cells/100㎕가 되도록 분주하되 상기 Ag pulsed DC와 K-ras(M)-ROP 특이 CD3+ T 세포의 세포수가 1:20의 비율이 되도록 하였다. Ag pulsed DC와 K-ras(M)-ROP 특이 CD3+ T 세포가 혼합된 배지는 4시간동안 배양하였다. 상기 FACS를 이용하여 배양된 세포들의 CD3+, CD4+, CD137+, IFN-γ cap, 및 IFN-γ 분비 T 세포 비율(%)을 분석하였다. 상기 Ag pulsed DC의 제조에 사용한 항원은 K-ras(M)-ROP(500aa)(ROP_DC), K-ras1-24wild type peptide(WT_DC), K-ras1-24G12D mutant peptide(G12D_DC), K-ras1-24G12V mutant peptide(G12V_DC), 및 K-ras1-24G13D mutant peptide(G13D_DC)이었다. 또한 비교를 위하여 항원(Ag) 없이 실행기(effector)만을 사용한 DC(NoAg_DC)를 사용하였다. First, autologous DCs were cultured for 4 days and sensitized to antigen to prepare Ag pulsed DCs. The Ag pulsed DCs were dispensed into 96-well at 5x103 cells/100㎕. K-ras(M)-ROP-specific CD3+ T cells were dispensed into the 96-well at 1x105 cells/100㎕, with a cell ratio of 1:20 between the Ag pulsed DCs and K-ras(M)-ROP-specific CD3+ T cells. The medium containing Ag pulsed DCs and K-ras(M)-ROP-specific CD3+ T cells was cultured for 4 hours. The ratios (%) of CD3+, CD4+, CD137+, IFN-γ cap, and IFN-γ secreting T cells of the cultured cells were analyzed using FACS. The antigens used in the production of the above Ag pulsed DC were K-ras (M)-ROP (500aa) (ROP_DC), K-ras 1-24 wild type peptide (WT_DC), K-ras 1-24 G12D mutant peptide (G12D_DC), K-ras 1-24 G12V mutant peptide (G12V_DC), and K-ras 1-24 G13D mutant peptide (G13D_DC). In addition, DC using only the effector without the antigen (Ag) (NoAg_DC) was used for comparison.

실험결과 ROP_DC를 사용하여 재자극한 경우 CD3+ ROP-T 세포에 존재하는 K-ras(M)-ROP 특이 CD3+/CD4+ T 세포와 K-ras(M)-ROP 특이 CD3+/CD8+ T 세포의 비율(%)이 각각 10% 및 5%인 것이 확인되었다. G12D_DC를 사용하여 재자극한 경우 CD3+ ROP-T 세포에 존재하는 K-ras(M)-ROP 특이 CD3+/CD4+ T 세포와 K-ras(M)-ROP 특이 CD3+/CD8+ T 세포의 비율(%)이 각각 1.5% 및 0.5%인 것이 확인되었다. G13D_DC를 사용하여 재자극한 경우 CD3+ ROP-T 세포에 존재하는 K-ras(M)-ROP 특이 CD3+/CD4+ T 세포와 K-ras(M)-ROP 특이 CD3+/CD8+ T 세포의 비율(%)이 각각 3.0% 및 1.5%인 것이 확인되었다. 이에 반하여 Wt_DC 및 G12V_DC를 사용하여 재자극한 경우 K-ras(M)-ROP 특이 CD3+/CD4+ T 세포와 K-ras(M)-ROP 특이 CD3+/CD8+ T 세포가 거의 검출되지 않았다.The experimental results showed that when restimulated using ROP_DC, the ratios (%) of K-ras(M)-ROP-specific CD3+/CD4+ T cells and K-ras(M)-ROP-specific CD3+/CD8+ T cells in CD3+ ROP-T cells were 10% and 5%, respectively. When restimulated using G12D_DC, the ratios (%) of K-ras(M)-ROP-specific CD3+/CD4+ T cells and K-ras(M)-ROP-specific CD3+/CD8+ T cells in CD3+ ROP-T cells were 1.5% and 0.5%, respectively. When restimulated with G13D_DC, the percentages (%) of K-ras(M)-ROP-specific CD3+/CD4+ T cells and K-ras(M)-ROP-specific CD3+/CD8+ T cells present in CD3+ ROP-T cells were confirmed to be 3.0% and 1.5%, respectively. In contrast, when restimulated with Wt_DC and G12V_DC, K-ras(M)-ROP-specific CD3+/CD4+ T cells and K-ras(M)-ROP-specific CD3+/CD8+ T cells were hardly detected.

9. ROP-T 세포의 HLA 제한 분석9. HLA restriction analysis of ROP-T cells

유도된 ROP-T 중 K-ras G13D mutant 특이 T 세포의 HLA 제한(restriction)을 확인하기 위해 인간 백혈구 항원(Human leukocyte antigen DQ, HLA-DQ) 에세이를 수행하였다. To confirm HLA restriction of K-ras G13D mutant-specific T cells among induced ROP-T, human leukocyte antigen DQ (HLA-DQ) assay was performed.

도 7은 본 발명의 HLA-DQ blocking 에세이 결과를 보여준다.Figure 7 shows the results of the HLA-DQ blocking assay of the present invention.

먼저 항원을 감작시킨 DC(Ag pulsed DC)를 제조하였다. 상기 Ag pulsed DC의 제조에 사용한 항원은 K-ras(M)-ROP(500aa)(ROP_DC), K-ras1-24wild type peptide(WT_DC), K-ras1-24G12D mutant peptide(G12D_DC), K-ras1-24G12V mutant peptide(G12V_DC), 및 K-ras1-24G13D mutant peptide(G13D_DC)이었다. 상기 제조한 Ag pulsed DC에 대하여 1시간동안 HLA-DQ 항체로 처리하는 방법으로 HLA-DQ blocking을 실시하였다. HLA-DQ blocking된 Ag pulsed DC를 이용하여 ROP-T를 재자극(re-stimulation)한 후 FACS 분석을 통해 IFN-γ+, CD3+, CD4+를 분석하였다. First, antigen-sensitized DC (Ag pulsed DC) was prepared. The antigens used in the preparation of the Ag pulsed DC were K-ras (M)-ROP (500aa) (ROP_DC), K-ras 1-24 wild type peptide (WT_DC), K-ras 1-24 G12D mutant peptide (G12D_DC), K-ras 1-24 G12V mutant peptide (G12V_DC), and K-ras 1-24 G13D mutant peptide (G13D_DC). HLA-DQ blocking was performed on the prepared Ag pulsed DC by treating it with HLA-DQ antibody for 1 hour. After re-stimulation of ROP-T using the HLA-DQ blocked Ag pulsed DC, IFN-γ+, CD3+, and CD4+ were analyzed through FACS.

분석결과 항원 비특이 T 세포(NoAg-T)은 재자극에 사용한 DC의 종류 및 상기 DC에 대한 HLA-DQ blocking의 여부에 상관없이 IFN-γ를 분비하는 CD3+CD4+ T 세포의 비율이 미미한 것으로 확인되었다. 이에 반하여 ROP-T 세포는 ROP_DC를 사용하여 재자극하게 되면 DC에 대한 HLA-DQ blocking 여부에 상관없이 IFN-γ를 분비하는 CD3+CD4+ T 세포의 비율이 15% 이상으로 증가하는 것으로 확인되었다. 또한 ROP-T 세포는 HLA-DQ blocked G13D_DC를 이용하여 재자극을 수행한 경우 IFN-γ를 분비하는 CD3+CD4+ T 세포의 비율이 HLA-DQ unblocked G13D_DC를 사용하여 재자극한 경우에 대비하여 6% 가량 감소(7% →1%)하는 것이 확인 되었다.The results of the analysis showed that the proportion of CD3+CD4+ T cells secreting IFN-γ was minimal for antigen-nonspecific T cells (NoAg-T), regardless of the type of DC used for restimulation and the presence or absence of HLA-DQ blocking on the DC. In contrast, when ROP-T cells were restimulated using ROP_DC, the proportion of CD3+CD4+ T cells secreting IFN-γ increased to more than 15%, regardless of the presence or absence of HLA-DQ blocking on the DC. In addition, when ROP-T cells were restimulated using HLA-DQ blocked G13D_DC, the proportion of CD3+CD4+ T cells secreting IFN-γ was confirmed to decrease by approximately 6% (7% → 1%) compared to when restimulated using HLA-DQ unblocked G13D_DC.

결과적으로 본 발명의 ROP-T 세포는 ROP 항원에 특이적이며 HLA-DQ에 제한적이며 G13D 돌연변이에 특이성을 보이는 CD4+ T 세포의 증폭을 유도하는 것으로 판단된다.As a result, it is judged that the ROP-T cells of the present invention induce the amplification of CD4+ T cells that are specific for ROP antigens, restricted to HLA-DQ, and specific for the G13D mutation.

10. 대조군 native K-ras-T 세포와 peptide mix-T 세포의 비교10. Comparison of control native K-ras-T cells and peptide mix-T cells

K-ras(M)-ROP의 K-ras 돌연변이에 대한 특이적인 반응 유도를 검증하였다. We verified the specific response induction of K-ras(M)-ROP to K-ras mutants.

도 8은 본 발명의 조건별 IFN-γ를 분비(IFN-γ+)하는 CD3+ T 세포의 비율을 보여준다. 먼저 K-ras(M)-ROP 또는 native K-ras(189aa)을 항원으로 사용하는 Fast-IVS 공정을 이용하여 T 세포를 유도하였다. 또한 K-ras1-24wild type 펩타이드, K-ras1-24G12D 펩타이드, K-ras1-24G12V 펩타이드, 및 K-ras1-24G13D 펩타이드 혼합물을 항원으로 사용하는 Fast-IVS 공정을 이용하여 T 세포를 유도하였다. 대조군으로는 항원없이 실행기만을 사용하는 Fast-IVS 공정을 이용하여 T 세포를 유도하였다. 상기 유도한 T 세포는 ROP_DC를 이용하여 재자극하고 FACS를 이용하여 IFN-γ+ CD3+ T 세포의 비율을 분석하였다.Figure 8 shows the ratio of CD3+ T cells secreting IFN-γ (IFN-γ+) according to the conditions of the present invention. First, T cells were induced using the Fast-IVS process using K-ras(M)-ROP or native K-ras(189aa) as an antigen. In addition, T cells were induced using the Fast-IVS process using a mixture of K- ras 1-24 wild type peptide, K-ras 1-24 G12D peptide, K-ras 1-24 G12V peptide, and K-ras 1-24 G13D peptide as antigens. As a control, T cells were induced using the Fast-IVS process using only an executor without an antigen. The induced T cells were restimulated using ROP_DC, and the ratio of IFN-γ+ CD3+ T cells was analyzed using FACS.

하기 표 5는 K-ras(M)-ROP의 K-ras 돌연변이에 대한 특이적인 반응 유도 검증 실험방법을 보여준다. 하기 표 5에 있어서 K-ras epitope wild type은 Native K-ras1-24(24aa)를 의미하며; K-ras epitope G12D는 K-ras1-24G12D(24aa)를 의미하며; K-ras epitope G12V는 K-ras1-24G12V(24aa)를 의미하며; K-ras epitope G13D는 K-ras1-24G13D(24aa)를 의미한다.Table 5 below shows the specific response induction verification experimental method for K-ras mutations of K-ras(M)-ROP. In Table 5 below, K-ras epitope wild type means Native K-ras 1-24 (24aa); K-ras epitope G12D means K-ras 1-24 G12D(24aa); K-ras epitope G12V means K-ras 1-24 G12V(24aa); K-ras epitope G13D means K-ras 1-24 G13D(24aa).

conditionsconditions Fast-IVSFast-IVS ExpansionExpansion AntigenAntigen CytokineCytokine DaysDays MediaMedia DaysDays No Ag-TNo Ag-T -- D0:IL-4, GM-CSF
D+1:TNF-a, IL-1b, PGE2D0:IL-4, GM-CSF
D+1:TNF-a, IL-1b, PGE2 7 Days7 Days Alys+IL-2+SR3%Alys+IL-2+SR3% 10 Days10 Days ROP-TROP-T K-ras(M)-ROP(8.5μM=5㎍/㎖)K-ras(M)-ROP(8.5μM=5㎍/㎖) Pep.-TPep.-T K-ras epitope(24mer) 4종 혼합물(wild type, G12D, G12V, G13D)(8.5μM)K-ras epitope (24mer) 4 types mixture (wild type, G12D, G12V, G13D) (8.5 μM) WT-TWT-T Native K-ras(8.5μM=2㎍/㎖)Native K-ras(8.5μM=2㎍/㎖)

실험결과 항원을 사용하지 않고 Fast-IVS를 통해 유도한 T 세포(No Ag-T)의 경우 IFN-γ+ CD3+ T 세포의 비율이 8% 수준인 것으로 확인되었다. K-ras(M)-ROP을 항원으로 사용하는 Fast-IVS 공정을 통해 유도한 T 세포(ROP-T)의 경우 IFN-γ+ CD3+ T 세포의 비율이 37.4%에 달하는 것으로 확인되었다. Native K-ras를 항원으로 사용하는 Fast-IVS 공정을 통해 유도한 T 세포(WT-T)의 경우 IFN-γ+ CD3+ T 세포의 비율이 18.4% 수준인 것으로 확인되었다. K-ras1-24wild type 펩타이드, K-ras1-24G12D 펩타이드, K-ras1-24G12V 펩타이드, 및 K-ras1-24G13D 펩타이드 혼합물을 항원으로 사용하는 Fast-IVS 공정을 통해 유도한 T 세포(Pep_T)의 경우 IFN-γ+ CD3+ T 세포의 비율이 19.0% 수준인 것으로 확인되었다. The experimental results showed that the proportion of IFN-γ+ CD3+ T cells was approximately 8% in the case of T cells induced through Fast-IVS without using an antigen (No Ag-T). The proportion of IFN-γ+ CD3+ T cells was approximately 37.4% in the case of T cells induced through the Fast-IVS process using K-ras(M)-ROP as an antigen (ROP-T). The proportion of IFN-γ+ CD3+ T cells was approximately 18.4% in the case of T cells induced through the Fast-IVS process using Native K-ras as an antigen (WT-T). In the case of T cells (Pep_T) induced through the Fast-IVS process using a mixture of K-ras 1-24 wild type peptide, K-ras 1-24 G12D peptide, K-ras 1-24 G12V peptide, and K-ras 1-24 G13D peptide as antigens, the ratio of IFN-γ+ CD3+ T cells was confirmed to be 19.0%.

정리하면 K-ras(M)-ROP 항원이 Native K-ras 또는 K-ras 돌연변이를 포함하는 에피토프를 사용하는 것보다 2배 가량 우수한 IFN-γ+ CD3+ T 세포 유도 효과가 있는 것으로 판단된다.In summary, it was determined that the K-ras(M)-ROP antigen had a IFN-γ+ CD3+ T cell induction effect that was approximately twice as superior to that using an epitope containing native K-ras or a K-ras mutation.

11. ROP-T 세포의 암세포 독성 효과 확인11. Confirmation of cancer cell toxicity of ROP-T cells

Fast-IVS 공정을 통해 유도한 T 세포(ROP-T)의 암세포 용해(killing) 효과를 확인하였다. 이를 위하여 유방선암(breast adenocarcinoma), 흑색종(melanoma), 대장선암(colorectal adenocarcinoma), 폐유두선암(lung papillary adenocarcinoma), 또는 폐대세포암(lung large cell carcinoma)의 세포주와 ROP을 항원으로 사용하는 Fast-IVS 공정을 이용하여 유도한 T 세포(ROP-T) 또는 항원을 사용하지 않는 Fast-IVS 공정을 이용하여 유도한 T 세포(LAK-T)를 함께 배양하여 각각의 T 세포가 각 암세포를 얼마나 용해하는지 확인하였다.The cancer cell killing effect of T cells (ROP-T) induced through the Fast-IVS process was confirmed. To this end, cell lines of breast adenocarcinoma, melanoma, colorectal adenocarcinoma, lung papillary adenocarcinoma, or lung large cell carcinoma were co-cultured with T cells induced using the Fast-IVS process using ROP as an antigen (ROP-T) or T cells induced using the Fast-IVS process without using an antigen (LAK-T), and the extent to which each T cell lysed each cancer cell was confirmed.

하기 표 6은 각 암종의 세포주에 대한 분석 정보를 보여준다.Table 6 below shows the analysis information for cell lines of each cancer type.

세포주명Cell line name 암종carcinoma K-ras 돌연변이K-ras mutation HLA-typeHLA type HLA-AHLA-A HLA-DR(B1)HLA-DR(B1) HLA-DQ(B1)HLA-DQ(B1) MCF7MCF7 유방선암
(breast adenocarcinoma)breast cancer
(breast adenocarcinoma) 없음doesn't exist 02:01, 02:0102:01, 02:01 15:01, 15:0115:01, 15:01 06:02, 06:0206:02, 06:02 526mel526mel 흑색종
(melanoma)Melanoma
(melanoma) 없음doesn't exist 02:01, 0302:01, 03 -- -- MDA MB231MDA MB231 유방선암
(breast adenocarcinoma)breast cancer
(breast adenocarcinoma) G13DG13D 02:17, 02:0102:17, 02:01 13:05, 07:0113:05, 07:01 03:04, 03:0403:04, 03:04 SW480SW480 대장선암
(colorectal adenocarcinoma)Colon cancer
(colorectal adenocarcinoma) G12VG12V 24:02, 02:0124:02, 02:01 13:27, 15:0113:27, 15:01 06:03, 05:0106:03, 05:01 NCI-H441NCI-H441 폐유두선암
(lung papillary adenocarcinoma)Pulmonary papillary adenocarcinoma
(lung papillary adenocarcinoma) G12VG12V 03:01, 02:0103:01, 02:01 13:23, 14:1013:23, 14:10 06:07, 06:0706:07, 06:07 T3M-10T3M-10 폐대세포암
(lung large cell carcinoma)pulmonary large cell carcinoma
(lung large cell carcinoma) G12DG12D 24:02, 11:0124:02, 11:01 11:01, 08:0311:01, 08:03 06:01, 03:0406:01, 03:04

분석결과 유방선암(breast carcinoma)의 세포주인 MCF7와 색종(melanoma)의 세포주인 526mel은 K-ras가 검출되었으나 돌연변이는 검출되지 않은 것으로 확인되었으며 유방선암(breast adenocarcinoma)의 세포주인 MDA MB231은 K-ras G13D 돌연변이; 대장선암(colorectal adenocarcinoma)의 세포주인 SW480 및 폐유두선암(lung papillary adenocarcinoma)의 세포주인 NCI-H441는 K-ras G12V 돌연변이; 및 폐대세포암(lung large cell carcinoma)의 세포주인 T3M-10은 K-ras G12D 돌연변이를 포함하고 있는 것으로 확인되었다.As a result of the analysis, it was confirmed that MCF7, a breast carcinoma cell line, and 526mel, a melanoma cell line, had K-ras detected but no mutations; MDA MB231, a breast adenocarcinoma cell line, had K-ras G13D mutations; SW480, a colorectal adenocarcinoma cell line, and NCI-H441, a lung papillary adenocarcinoma cell line, had K-ras G12V mutations; and T3M-10, a lung large cell carcinoma cell line, had K-ras G12D mutations.

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도 9는 본 발명의 ROP-T세포의 암세포에 대한 독성실험결과를 보여준다.Figure 9 shows the results of a toxicity test on cancer cells of the ROP-T cells of the present invention.

실험결과 본 발명의 ROP-T 세포는 ROP 항원처리를 수행하지 않은 LAK-T 세포에 대비하여 유방선암세포, 흑색종세포, 대장선암세포, 폐유두선암세포, 및 폐대세포암세포에 대한 독성이 유의미한 수준으로 높은 것으로 확인되었다. As a result of the experiment, it was confirmed that the ROP-T cells of the present invention have significantly higher toxicity against breast adenocarcinoma cells, melanoma cells, colon adenocarcinoma cells, lung papillary adenocarcinoma cells, and lung large cell carcinoma cells compared to LAK-T cells that have not undergone ROP antigen treatment.

대장암 환자로부터 암조직을 수득한 후 HLA-typing 및 K-ras 돌연변이에 대한 검사를 수행하였다. After obtaining cancer tissue from a colon cancer patient, tests for HLA-typing and K-ras mutation were performed.

하기 표 7은 대장암 환자로부터 수득한 암세포(primary culture)에 대한 검사결과를 보여준다.Table 7 below shows the test results for cancer cells (primary culture) obtained from colon cancer patients.

암종carcinoma K-ras 돌연변이K-ras mutation HLA-typeHLA type HLA-AHLA-A HLA-DR(B1)HLA-DR(B1) HLA-DQ(B1)HLA-DQ(B1) 대장암(Colorectal cancer)Colorectal cancer G12DG12D 02:01, 24:0202:01, 24:02 04:06, 12:0104:06, 12:01 03:01, 03:0203:01, 03:02

상기 대장암 환자의 암조직으로부터 primary culture 수행하여 대장암 세포를 수득하고 ROP을 항원으로 사용하는 Fast-IVS 공정을 이용하여 유도한 T 세포(ROP-T) 또는 항원을 사용하지 않는 Fast-IVS 공정을 이용하여 유도한 T 세포(LAK-T)를 함께 배양하여 각각의 T 세포가 대장암세포의 생장을 얼마나 억제하는지 확인하였다. Colon cancer cells were obtained by performing primary culture from the cancer tissue of the above colon cancer patient, and T cells induced using the Fast-IVS process using ROP as an antigen (ROP-T) or T cells induced using the Fast-IVS process not using an antigen (LAK-T) were cultured together to determine how much each T cell suppresses the growth of colon cancer cells.

도 10은 본 발명의 ROP-T세포의 대장암 환자의 암세포에 대한 growth curve를 분석한 결과를 보여준다. 실험 결과 본 발명의 ROP-T세포는 LAK-T세포에 대비하여 10%가량 대장암세포의 생장을 억제하는 것으로 확인되었다.Figure 10 shows the results of analyzing the growth curve of the ROP-T cells of the present invention against cancer cells of colon cancer patients. As a result of the experiment, it was confirmed that the ROP-T cells of the present invention inhibited the growth of colon cancer cells by about 10% compared to LAK-T cells.

본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다. The specific embodiments described in this specification are meant to represent preferred embodiments or examples of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereby. It will be apparent to those skilled in the art that modifications and other uses of the present invention do not depart from the scope of the invention described in the claims of this specification.