KR20210078704A - 중뇌 오가노이드 제조방법 - Google Patents

본 발명은 SMAD 억제제 및 WNT 신호전달체계의 아고니스트인 CHIR99021을 유효성분으로 포함하는 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용하여 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화시키는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 배지 조성물을 이용하여 줄기세포를 배양하는 경우 높은 효율로 균질한 중뇌 세포로 분화시킬 수 있고, 본 발명의 제조방법으로 제조한 중뇌 오가노이드를 다양한 신약개발 및 질환모사 연구에 활용할 수 있는 플랫폼으로 활용할 수 있고 조직이식 분야에도 활용할 수 있다.

중뇌 오가노이드 제조방법{METHOD OF PRODUCTION FOR MIDBRAIN OGARNOID}

본 발명은 SMAD 억제제와 WNT 신호전달체계의 아고니스트(agonist)인 CHIR99021을 유효성분으로 포함하는 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용하여 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

인간의 장기는 한 가지의 세포가 아닌 수십종의 세포가 유기적으로 결합되어 특이적인 기능을 수행하는 고도로 발달된 구조로 이루어져 있다. 그러므로, 줄기세포기반 질환모델링 및 신약스크리닝 연구의 정확성과 신뢰성을 극대화하기 위해서는 실제 장기의 구조생리학적, 환경적 특성을 모사할 수 있는 3차원 분화기술 기반 생체모방형 연구시스템 개발이 필수적으로 요구되고, 이는 향후 질환모델링 및 신약스크리닝의 차세대 플랫폼을 개발하는데 요긴하게 사용될 것으로 판단된다.

3D 오가노이드 기술은 생체조직의 복잡한 구조를 높은 수준으로 모사할 수 있는 분화기술로써, 기존의 2차원적 분화기법에 비해서 실제 조직의 구조적, 생리학적 및 기능적 특성을 보다 완벽하게 재현할 수 있는 기술로 평가받고 있다. 이러한 이유로 3D 오가노이드 기술은 최근 전세계적으로 연구가 활발히 이루어지고 있고, 지속적인 연구 및 개발가능성이 큰 줄기세포 분화기술로 주목 받고 있다.

최근 인간 배아줄기세포(ESC) 및 역분화줄기세포(iPSC)를 이용한 다양한 중추신경계 조직(대뇌피질, 안배, 해마, 소뇌, 뇌하수체)을 모사하고 있는 3D 오가노이드의 생산기술이 개발되고 있고, 그 유도된 3D 오가노이드는 실제 중추신경계의 발생학적, 구조적 및 생리학적 특성을 매우 높은 수준으로 모사하고 있다. 특히, 최근 개발된 중뇌 오가노이드는 도파민성 신경세포와 그 전구세포로 이루어진 신경세포층 및 중뇌 특이적 뉴로멜라닌 축적을 체내 조직과 매우 유사한 수준으로 모사함으로써, 인간 중뇌의 구조생리학적 특성연구 및 퇴행성 뇌질환 기전연구에 적합하다는 것이 증명되었다.

다만, 현재 대부분의 중추신경계 3D 오가노이드 생산기술의 경우, 분화과정을 정밀하게 제어할 수 있는 기술의 부재로 인한 비균질한 구조의 한계점을 가지고 있는 실정이다. 현재 ESC로부터 중뇌 오가노이드로의 분화시 중뇌 특이적 바닥판(floor plate) 구조 뿐 아니라, 대뇌피질의 신경세포상피층, 전두전엽(prefrontal lobe), 맥락총(choroid plexus), 망막(retina) 등과 같은 다양한 중추신경조직들로의 비균질한 분화가 빈번히 관찰되며, 이러한 비균질 분화과정은 중뇌 등 특정 뇌구조 기반의 질환모델링 등을 위해서 반드시 개선되어야 하는 문제점으로 지적되고 있으나, 현재 단일 오가노이드 내에서 특정 신경계 구조(예: 중뇌)로만 유도 가능한 고순도 분화기법의 개발은 전무한 실정이다. 최근 배아줄기세포에서 일차적으로 분화시킨 신경줄기세포에서 균질한 중뇌 오가노이드로를 생산한 사례가 있지만, 이 경우 성체줄기세포인 신경줄기세포를 사용하였기 때문에 배아줄기세포 및 역분화줄기세포에서 직접 중뇌 오가노이드를 만든 경우와는 다르게 중뇌의 구조가 재현되지 못하는 문제를 보였고 뉴로멜라닌의 분비 측면에서는 여전히 비균질한 양상을 보였다.

이에, 본 발명자들은 특정 화합물을 이용하여 줄기세포로부터 높은 효율로 균질한 중뇌 오가노이드로 분화시키는 기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 SMAD 억제제 및 WNT 신호전달체계의 아고니스트(agonist)인 CHIR99021을 유효성분으로 포함하는 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포를 SMAD 억제제를 포함하는 배지 조성물에서 배양하여 중뇌로 분화키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 중뇌 오가노이드 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 중뇌 오가노이드 제조방법에 의해서 제조된 중뇌 오가노이드를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SMAD 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 줄기세포를 SMAD 억제제를 포함하는 배지 조성물에서 배양하여 중뇌로 분화키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 중뇌 오가노이드 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 중뇌 오가노이드 제조방법에 의해서 제조된 중뇌 오가노이드를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다.

본 발명의 하나의 양태는 SMAD 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물에 관한 것이다.

SMAD 단백질은 TGF-β(transforming growth factor-β) 신호 전달에서 중요한 역할을 하며, 신호전달을 위해 원형질 막(plasma membrane)에서 핵으로 이동한다. SMAD 단백질은 TGF-β와 상호작용하여 분화 및 세포자살 등을 조절한다. TGF-β수용체 키나제는 리간드가 결합하면 SMAD1과 SMAD5 또는 SMAD2와 SMAD3의 C-말단에 위치한 세린 잔기를 인산화시킨다[Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1997, 64:10669-74; Souchelnytskyi et al., J. Biol. Chem., 1997, 272:2810 7-15; Abdollah et al., J. Biol. Chem., 1997, 272:27678-85]. 상기 인산화된 SMAD들은 SMAD4와 헤테로다이머(heterodimers)를 형성하여 핵으로 이동하게 되고[Lagna et al., Nature, 1996, 383:832-6], 여기서 SMAD는 목적 유전자의 전사(transcription)를 촉진한다[Attisano and Wrana, Curr. Opin. Cell Biol., 2000, 12:235-43; Kijke et al., Trends Biochem Sci., 2000, 25:64-70]. SMAD에 대한 목적 모티프(motif)가 인간 PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1)과 같은 TGF-β 반응 유전자의 프로모터에 존재하기 때문에 수용체-특이 SMAD3 및 SMAD4는 DNA에 직접 결합한다[Dennler et al., EMBO J., 1998, 17:3091-100]. TGF-β는 SMAD3 및 SMAD4 전사 인자가 인접한 프로모터에 결합하는 것을 통해 유도 억제자인 SMAD7 유전자의 전사를 유도한다[von Gersdorff et al., J. Biol. Chem., 2000, 275:11320-6].

상기 SMAD 억제제는 SMAD 단백질의 활성을 억제하는 화합물, 항체, 펩티드,또는 압타머를 의미할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예로서, 상기 SMAD 억제제는 6-[4-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]phenyl]-3-(4-pyridinyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine dihydrochloride(도르소모핀, Dorsomorphin), 4-[6-(4-piperazin-1-ylphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline(LDN193189), 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide(SB431542), 3-(6-methylpyridin-2-yl)-N-phenyl-4-quinolin-4-ylpyrazole-1-carbothioamide(A83-01) 및 Noggin 단백질(서열번호 1)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 6-[4-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]phenyl]-3-(4-pyridinyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine dihydrochloride(Dorsomorphin) 및 3-(6-methylpyridin-2-yl)-N-phenyl-4-quinolin-4-ylpyrazole-1-carbothioamide(A83-01)일 수 있다.

상기 도르소모핀(Dorsomorphin)은 1 uM 내지 10 uM의 농도로 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 1 내지 4 uM의 농도이고, 보다 더욱 바람직하게는 1 내지 2 uM의 농도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 LDN193189은 5 nM 내지 10 uM의 농도로 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 5 nM 내지 500 nM의 농도이고, 보다 더욱 바람직하게는 50 nM 내지 100 nM의 농도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 SB431542은 50 nM 내지 50 uM의 농도로 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 1 uM내지 25 uM의 농도이고, 보다 더욱 바람직하게는 5 uM 내지 10 uM의 농도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 A83-01은 1 내지 10 uM의 농도로 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 1 내지 4 uM의 농도이고, 보다 더욱 바람직하게는 1 내지 2 uM의 농도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 Noggin 단백질은 10 ng/mL 내지 1 ug/mL의 농도로 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 50 ng/mL 내지 500 ng/mL의 농도이고, 보다 더욱 바람직하게는 100 내지 200 ng/mL의 농도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 배지 조성물은 SMAD 억제제 이외에 6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile(CHIR99021)를 추가적으로 더 포함할 수 있고, 상기 CHIR99021은 다양한 염 형태, 약학적으로 허용가능한 염 형태로 존재할 수 있으며, 예를 들어, 소듐, 칼륨 등의 알칼리 금속염 형태로 존재할 수 있다.

상기 CHIR99021는 0.1 uM 내지 20 uM의 농도로 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 0.1 uM 내지 10 uM의 농도이고, 보다 더욱 바람직하게는 2 uM 내지 3 uM의 농도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 도르소모핀, LDN193189, SB431542, A83-01, Noggin 단백질, 또는 CHIR99021, 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 그 용매화물은 본원의 목적에 부합하는 한, 목적하는 구체적 세포의 종류에 따라 적절한 농도로 포함할 수 있다.

본원에서 도르소모핀, LDN193189, SB431542, A83-01 및 Noggin 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 것에 비해서 도르소모핀, LDN193189, SB431542, A83-01 및 Noggin 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지 조성물에 CHIR99021을 추가하여 줄기세포를 배양하면, Wnt 신호의 활성화를 유도하여 중뇌 오가노이드로의 분화가 더욱 현저하게 촉진될 수 있다.

본원의 용어 "줄기세포"는 한 개의 세포가 여러 종류의 다른 세포를 생산해 낼 수 있는 다중 분화능을 가진 세포로서, 우리 몸의 손상받은 부위의 세포들을 새로 재생할 수 있는 세포들을 통칭한다. 줄기세포는 자신과 동일한 세포를 지속적으로 만들어 낼 수 있는 자가 재생산 능력, 특정 환경에서 기능성 특정 세포로 분화할 수 있는 분화능, 면역세포와 반응하여 면역반응을 조절하는 면역 조절능을 갖는다. 줄기세포의 종류는 분화되는 세포의 영역에 따라 인체를 구성하는 200여 가지의 세포로 모두 분화할 능력을 가진 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)와 특정 종류의 세포로 분화할 수 있도록 특화된 조직-특이적 줄기세포(tissue-specific stem cell)로 나눌 수 있다. 또한 줄기세포를 획득하기 위한 공급원에 따라 수정란에서 출발한 배아 또는 배반포(blastocyte)에서 얻어지는 배아줄기세포(embryonic stem cell)와 발생 과정이 끝난 신생아 또는 성인의 신체 각 조직에서 얻어지는 성체줄기세포(adult stem cell)로 분류될 수 있다.

본원에서 용어 "배아줄기세포(embryonic stem cell)"는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)일 수 있는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함한다. 배아체는 배아줄기세포의 다양한 조직 형태로의 자발적 분화 과정에서 줄기세포에 의해 형성된 중간구조이며, 배아 줄기 세포의 배양 중에 형성된 응집물(aggregate) 형태이다. 한편, 본 발명의 배아줄기세포는 인간을 포함한 포유동물로부터 유래할 수 있고, 바람직하게는 인간 배아줄기세포이다.

배아줄기세포는 외배엽, 중배엽 및 내배엽성 줄기세포로 분화할 수 있다.

본원에서 상기 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic stem cell) 또는 유도만능줄기세포(induced Pluripotent stem cell)를 포함하는 전분화능 줄기세포에서 유래한 것일 수 있고, 상기 줄기세포는 통상적으로 당업계에 공지된 어떠한 방법을 이용하여 획득할 수 있다.

본원에서 용어 “분화(differentiation)”란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 다능성 베아줄기세포는 계통이 한정된 전구세포(예컨대, 외배엽성 세포, 중배엽성 세포 또는 내배엽성 세포 등)로 분화한 후, 다른 형태의 전구세포로 더 분화될 수 있고, 그 뒤 특정 조직(예컨대, 중뇌 등)에서 특징적인 역할을 수행하는 말기 분화세포(예컨대, 중뇌세포 등)로 분화될 수 있다. 한편, 본 발명에서는 특정 조합의 SMAD 억제제 및 WNT 신호전달체계의 아고니스트(agonist)인 CHIR99021을 유효성분으로 포함하는 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 경우 중뇌 오가노이드 또는 중뇌 세포로 분화가 촉진됨을 확인하였다.

본원에서 용어 "유도만능줄기세포" 또는 "iPSC"는 체세포 또는 이미 분화된 세포를 처리하여 만능 분화성을 갖게 된 세포를 의미한다. 여기에서 처리하는 방법은 화합물, 유전적 변환 또는 특정 조건으로 배양하는 방법 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. "인간 유도만능줄기세포" 또는 "hiPSC"는 인간의 체세포 또는 인간의 분화된 세포를 처리하여 만능분화성을 갖게 된 세포를 의미한다. 상기의 인간 유도만능줄기세포는 섬유아세포 유래일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 혈액 등 다양한 기원으로부터 유래할 수 있다. 또한, 상기 인간 유도만능줄기세포는 인간 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 등 리프로그래밍 관련 유전자를 발현시켜 제작될 수 있다. 이때, Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 유전자 등의 발현은 레트로바이러스 감염 또는 에피조말 시스템(episomal system)을 통해 유래될 수 있다.

본원에서 특정 조합의 SMAD 억제제는 줄기세포를 중뇌 세포 또는 중뇌 오가노이드로 분화시키는 효과를 나타내기 위해서, 줄기세포배양 또는 줄기세포를 중뇌세포로 분화시키는데 사용되는 통상의 배지에 첨가되어 사용될 수 있다.

구체적으로, 본원의 SMAD 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 경우 줄기세포에서 중뇌 세포 또는 중뇌 오가노이드로 분화되는 효율이 현저하게 증가하고, 균질하고 우수한 기능의 중뇌 세포로 분화되는 비율이 현저하게 증가한다.

또한, 본원의 SMAD 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하여 중뇌 오가노이드로 분화시키는 경우 생체내에서 분화되어 존재하는 중뇌와 유사한 특성을 가지면서, 균질한 특성의 중뇌 세포들로 구성된 중뇌 오가노이드를 수득할 수 있다.

본원에서 줄기세포 배양에 사용되는 배지는 이 기술분야의 통상의 기술자들에게 널리 알려진 배지라면 제한없이 사용될 수 있다. 상기 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α―MEM(α―Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), 또는 mTESR(Stabilized feeder-free maintenance medium for human ES and iPS cells), E8(TESR-E8 medium for hESC/hiPSC maintenance), AlphaSTEM™ Naive hPSC Medium(Biocompare), PLUSTEM(HumanES/iPSC medium, Life science resaerch)을 예로 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에서 용어 " 분화(differentiation)"는, 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 본 발명에서 분화는 줄기세포에서 특정세포로 완전히 분화가 유도된 경우뿐만 아니라 줄기세포에서 특정세포로의 완전 분화되기 전 중간 단계에서 형성되는 배아유사구조체(embryonic body)의 형성도 포함하는 것이다.

또 하나의 양태로 본 발명은 줄기세포를 SMAD 억제제를 포함하는 배지 조성물에서 배양하여 중뇌로 분화키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 중뇌 오가노이드 제조방법에 관한 것이다.

상기 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물에 관한 사항은 중뇌 오가노이드 제조방법의 본질에 벗어나지 않는 한도에서 중뇌 오가노이드 제조방법에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다.

본원의 줄기세포를 SMAD 억제제를 포함하는 배지 조성물에서 배양하여 중뇌로 분화키는 단계에서 도르소모핀, LDN193189, SB431542, A83-01 및 Noggin 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 것에 비해서 도르소모핀, LDN193189, SB431542, A83-01 및 Noggin 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지 조성물에 CHIR99021을 추가하여 줄기세포를 배양하면, Wnt 신호의 활성화를 유도하여 중뇌 오가노이드로의 분화가 더욱 현저하게 촉진될 수 있다.

본원에서 상기 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic stem cell) 또는 유도만능줄기세포(induced Pluripotent stem cell)일 수 있고, 상기 줄기세포는 통상적으로 당업계에 공지된 어떠한 방법을 이용하여 획득할 수 있다.

구체적으로, 상기 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물을 줄기세포에 처리하여 배양하는 경우 중뇌 세포로 분화되는 효율이 현저하게 증가하고, 우수한 기능을 가진 균질한 중뇌 세포로 분화되는 비율이 현저하게 증가한다.

또 하나의 양태로 본 발명은 상기 중뇌 오가노이드 제조방법에 의해서 제조된 중뇌 오가노이드에 관한 것이다.

상기 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물에 관한 사항은 중뇌 오가노이드 제조방법에 의해서 제조된 중뇌 오가노이드의 본질에 벗어나지 않는 한도에서 중뇌 오가노이드 제조방법에 의해서 제조된 중뇌 오가노이드에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다.

본 발명의 중뇌 오가노이드 제조방법에 의해서 제조된 중뇌 오가노이드는 균질한 중뇌 세포로 구성되어 있고, 본 발명의 제조방법으로 제조한 중뇌 오가노이드를 다양한 신약개발 및 질환모사 연구에 활용할 수 있는 플랫폼으로 활용할 수 있고 조직이식 분야에도 활용할 수 있다.

본 발명의 배지 조성물을 이용하여 줄기세포를 배양하는 경우 높은 효율로 균질한 중뇌 오가노이드로 분화시킬 수 있고, 본 발명의 제조방법으로 제조한 중뇌 오가노이드를 다양한 신약개발 및 질환모사 연구에 활용할 수 있는 플랫폼으로 활용할 수 있고 조직이식 분야에도 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 중뇌 오가노이드 제조방법에 대한 모식도이다.
도 2는 다양한 조합의 SMAD 억제제 처리군 배상체(EB, embryoid bodies)의 형태학적 분석 및 생존율를 나타낸 결과이다.
도 3은 다양한 조합의 SMAD 억제제 처리군의 유전자 발현양상을 나타낸 결과이다.
도 4는 다양한 조합의 SMAD 억제제 처리군에서 도파민성신경세포의 존재를 공초점현미경으로 확인한 결과이다. ACSL1은 도파민전구세포 표시인자이고, TH는 도파민성신경세포의 표시인자를 의미한다.
도 5는 다양한 조합의 SMAD 억제제 처리군의 유전자 발현양상을 나타낸 결과이다.
도 6은 다양한 조합의 SMAD 억제제 처리군의 도파민성신경세포의 분포를 공초점현미경으로 확인한 결과이다. MO는 중뇌 오가노이드이고, MAP2는 신경세포 표시인자이고, TH는 도파민성신경세포의 표시인자를 의미한다.
도 7은 다양한 조합의 SMAD 억제제 처리군의 도파민성신경세포의 분포를 확인한 결과이다.
도 8은 0, 0.8, 2 및 3 uM의 CHIR99021를 처리하여 줄기세포를 분화시킨 경우 전체 유전자의 발현을 분석한 결과이고, 3 uM의 CHIR99021를 처리한 경우 신경세포관련 유전자들이 가장 잘 활성화되었었다.
도 9는 0, 0.8, 1.5, 2, 2.5 및 3 uM의 CHIR99021를 처리하여 줄기세포를 분화시킨 경우 중뇌 특이적 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 10은 0, 0.85, 2 및 3 uM의 CHIR99021를 처리하여 줄기세포를 분화시킨 경우 중뇌와 대뇌 유전자의 발현을 분석한 결과이다.
도 11은 0, 0.8, 1.5, 2, 2.5 및 3 uM의 CHIR99021를 처리하여 줄기세포를 분화시킨 경우 도파민성신경세포의 분포를 공초점현미경으로 확인한 결과이다.
도 12는 3 uM의 CHIR99021를 처리하여 줄기세포를 분화시킨 경우 중뇌 오가노이드의 구조를 공초점현미경으로 분석한 결과이다.
도 13은 3 uM의 CHIR99021를 처리하여 줄기세포를 분화시킨 경우 중뇌 오가노이드의 구조를 전자현미경으로 분석한 결과이다.
도 14는 3 uM의 CHIR99021를 처리하여 줄기세포를 분화시킨 경우 도파민 생성능력을 분석한 결과이다.
도 15는 3 uM의 CHIR99021를 처리하여 줄기세포를 분화시킨 경우 중뇌 오가노이드의 전기생리학적 분석 결과이다.
도 16은 3 uM의 CHIR99021를 처리하여 줄기세포를 분화시킨 경우 중뇌 오가노이드내 뉴로멜라빈 생성을 분석한 결과이다.
도 17은 3 uM의 CHIR99021를 처리하여 줄기세포를 분화시킨 후 생성된 중뇌 오가노이드에 MPTP를 처리한 후 도파민성신경세포의 선택적 사멸을 공초점 현미경으로 분석한 결과이다.
도 18은 3 uM의 CHIR99021를 처리하여 줄기세포를 분화시킨 후 생성된 중뇌 오가노이드에 MPTP를 처리한 후 도파민성신경세포의 선택적 사멸을 공초점 현미경으로 분석하기 위해서 Caspase 3 양성 뉴런세포의 비율 또는 TUNEL 양성 뉴런세포의 비율을 분석한 결과이다.
도 19는 3 uM의 CHIR99021를 처리하여 줄기세포를 분화시킨 후 생성된 중뇌 오가노이드에 MPTP를 처리한 후 도파민성신경세포 이외의 세포 사멸을 공초점 현미경으로 분석한 결과이다.

이하, 본 발명을 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

실시예 1. SMAD 저해제를 이용하여 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화유도

단일세포로 해리된 1 x 10⁴ 개의 인간 배아줄기세포(Human embryonic stem cell line(H9, WiCELl WA09)) 부착저해코팅이 된 U-bottom 96 well plate(Coasta, CLS3474-24EA)에 배양하여 구형의 배양체를 형성시키고, 24시간 후 0.8 uM CHIR99021(Tocris, 4423)를 포함한 신경외배엽분화배지(표 1)에 DA(2uM Dorsomorphin(Biogems, 8666430)+ 2 uM A83-01(Biogems, 9094360)를 첨가하여 제조한 중뇌분화배지를 상기 배양체에 처리하여 초기단계의 중뇌조직으로 분화를 유도하였다(도 1).

분화 4일차에 상기 중뇌분화배지에 100 ng/ul의 FGF8(Peprotech, 100-25)및 100 ng/ul의 SAG(Carbosynth, FS27779)를 첨가하여 중뇌바닥판(midbrain floor plate)으로의 분화를 유도하고, 분화 7일차에 각각의 배양체를 마트리젤(Matrigel, Corning, 354277) 방울로 포매(메트리젤이란 일종의 젤 성분으로 말랑말랑한 방울을 만들고 그 안에 오가노이드를 집어 넣음)하여 뇌조직성숙화 배지(표 2)로 옮겨 배양하였다. 그리고 나서, 분화 9일차에 안정화된 배양체를 16개/배양접시(6 cm petri-dish, SPL 10035)의 비율로 옮긴 후 85 rpm의 속도로 흔들며 장기배양(orbital shaker, Thermo, 25870)하여 중뇌 오가노이드로 성숙화하였다.

실시예 2. SMAD 저해제(NS)

실시예 1과 같은 방법으로 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화유도하되, DA(2uM Dorsomorphin + 2 uM A83-01) 대신에 NS(200ng/ml Noggin(Peprotech, 120-10c) + 10uM SB431542(Peprotech, 3014193)를 신경외배엽분화배지에 처리하였다.

실시예 3. SMAD 저해제(LS)

실시예 1과 같은 방법으로 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화유도하되, DA(2 uM Dorsomorphin + 2 uM A83-01) 대신에 LS(100 nM LDN(Biogems, 1066208) + 10 uM SB431542(Peprotech, 3014193)를 신경외배엽분화배지에 처리하였다.

비교예 1. SMAD 저해제(DS)

실시예 1과 같은 방법으로 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화유도하되, DA(2uM Dorsomorphin + 2 uM A83-01) 대신에 DS(10 uM Dorsomorphin(Biogems, 8666430) + 10 uM SB431542(Peprotech, 3014193)를 신경외배엽분화배지에 처리하였다.

실시예 4. WNT 신호증가를 이용하여 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화유도

실시예 1과 같은 방법으로 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화유도하되, 0.8 uM CHIR99021 대신에 1.5 uM CHIR99021를 신경외배엽분화배지에 처리하였다.

실시예 5.

실시예 1과 같은 방법으로 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화유도하되, 0.8 uM CHIR99021(Tocris, 4423) 대신에 2 uM CHIR99021(Tocris, 4423)를 신경외배엽분화배지에 처리하였다.

실시예 6.

실시예 1과 같은 방법으로 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화유도하되, 0.8 uM CHIR99021(Tocris, 4423) 대신에 2.5 uM CHIR99021(Tocris, 4423)를 신경외배엽분화배지에 처리하였다.

실시예 7.

실시예 1과 같은 방법으로 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화유도하되, 0.8 uM CHIR99021(Tocris, 4423) 대신에 3 uM CHIR99021(Tocris, 4423)를 신경외배엽분화배지에 처리하였다.

비교예 2.

실시예 1과 같은 방법으로 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화유도하되, DA(2uM Dorsomorphin + 2 uM A83-01) 대신에 0.1%(v/v) DMSO(Sigma-Aldrich, D 2650)를 신경외배엽분화배지에 처리하였다.

실험예 1. SMAD 저해제를 이용하여 분화시킨 중뇌 오가노이드의 특성 분석

SMAD 저해제를 이용하여 분화시킨 중뇌 오가노이드의 특성을 분석하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험예 1-1. 배상체 형성

실시예 1 내지 3 및 비교예 1과 같은 방법으로 SMAD 저해제를 이용하여 분화시킨 중뇌 오가노이드의 특성을 분석하였다.

구체적으로, 실시예 1 내지 3 및 비교예 1과 같은 방법을 이용하여 인간 배아줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화유도하기 위한 첫 단계로 서로다른 SMAD 저해제가 처리된 인간 배아줄기세포의 배상체 형성을 현미경을 이용하여 확인하였다.

그 결과 도 2에 나타난 것과 같이, SMAD 저해제를 NS(실시예 2), DA(실시예 1) 및 LS(실시예 3)로 사용한 경우 배상체 형성이 효율적으로 이루어졌으나, DS(비교예 1)로 사용한 경우 배상체가 잘 형성되지 않고 세포들이 죽는 현상을 확인할 수 있었다.

실험예 1-2. 신경분화 확인을 위한 유전자 발현 분석

신경분화 확인을 위해서 실시예 1 내지 3 및 비교예 1과 같은 방법을 이용하여 분화된 조직을 qPCR을 이용하여 분석하였다.

qPCR에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 3에 기재되어 있다.

그 결과 도 3에 나타난 것과 같이, SMAD 저해제를 NS(실시예 2), DA(실시예 1) 및 LS(실시예 3)로 사용한 경우 신경 외배엽 관련 마커인 SOX2, N-CAD, OTX2, PLZF 등의 유전자 발현이 증가하여 신경분화가 특이적으로 일어났으나, DS(비교예 1)로 사용한 경우 세포사멸인자인 BOK, BAX, BAD 등의 유전자 발현양의 증가와 EMOES, SOX17, T 유전자 발현양의 증가를 통해 세포 사멸이 유도되면서 내배엽, 중배엽으로의 분화가 일어남을 확인할 수 있었다.

실험예 1-3. 중뇌 도파민성신경세포의 활성 분석

실시예 1 내지 3과 같은 방법을 이용하여 분화된 중뇌 오가노이드를 공초현미경으로 확인하여 중뇌 도파민성신경세포의 활성을 분석하였다.

공초점현미경을 이용하여 관찰하기 위해서 ASCL1(BD Pharmingen, 556604) 및 TH(Abcam, ab152) 항체를 사용하였다.

한편, 비교예 1의 경우 생존하는 중뇌 오가노이드가 없었기 때문에 분석에 사용하지 않았다.

그 결과 도 4에 나타난 것과 같이, SMAD 저해제를 NS(실시예 2), DA(실시예 1) 및 LS(실시예 3)로 사용한 경우 중뇌 도파민성신경세포의 표시유전자(TH) 발현이 확인되어 중뇌 오가노이드내에 중뇌 도파민성신경세포(Midbrain dopaminergic neurons, mDA)가 존재함을 확인할 수 있었다.

실험예 1-4. 중뇌 활성 마커 유전자의 발현 분석

실시예 1 내지 3과 같은 방법을 이용하여 분화된 조직을 중뇌 활성 마커 유전자의 발현을 확인하기 위해서 qPCR 분석을 수행하였다.

한편, 비교예 1의 경우 생존하는 중뇌 오가노이드가 없었기 때문에 분석에 사용하지 않았다.

qPCR에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 4에 기재되어 있다.

그 결과 도 5에 나타난 것과 같이, SMAD 저해제를 DA(실시예 1) 와 LS(실시예 3)로 사용한 경우 중뇌 활성 마커 유전자(LRTM1, DAT, TH, LMX1B, LMX1A, ASC1, PAX3)의 발현이 확인되었지만 NS(실시예 2)로 사용한 경우 대뇌 표시유전자(FOXG1, LHX2, SIX3)의 발현이 동시에 이루어져 중뇌 오가노이드 생산에 DA(실시예 1) 와 LS(실시예 3)가 보다 효율적임을 확인할 수 있었다.

실험예 1-5. TH 양성세포의 분석

실시예 1 내지 3과 같은 방법을 이용하여 분화된 중뇌 오가노이드를 공초점현미경으로 조사하여 TH 양성세포 숫자 및 분포을 분석하였다.

공초점현미경을 이용하여 관찰하기 위해서 MAP2(Millipore Merck, 05-346) 및 TH(Abcam, ab152) 항체를 사용하였다.

한편, 비교예 1의 경우 생존하는 중뇌 오가노이드가 없었기 때문에 분석에 사용하지 않았다.

그 결과 도 6 및 7에 나타난 것과 같이, SMAD 저해제 DA(실시예 1)로 사용한 경우, 높은 숫자의 중뇌 도파민성신경세포가 균질하게 존재하였으나, NS(실시예 2) 및 LS(실시예 3)로 사용한 경우 매우 적은 수의 중뇌 도파민성신경세포가 비균질하게 존재함을 확인할 수 있었다.

실험예 2. WNT 신호증가를 이용하여 분화시킨 중뇌 오가노이드의 특성 분석

CHIR99021의 처리 농도를 증가하여 WNT 신호를 증킨 경우 분화된 중뇌 오가노이드의 특성을 분석하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험예 2-1. 신경관련 유전자의 발현 분석

실시예 1, 실시예 4 내지 7 및 비교예 2와 같은 방법을 이용하여 분화된 중뇌 오가노이드의 글로벌 유전자 발현양상을 RNA sequencing 기법으로 분석하였다.

그 결과 도 8에 나타난 것과 같이, 2 내지 3 uM 농도의 CHIR99021를 처리했을 때 신경관련 유전자들의 발현이 유의하게 증가됨을 확인할 수 있었다.

실험예 2-2. 중뇌 유전자의 발현 분석

실시예 1, 실시예 4 내지 7 및 비교예 2와 같은 방법을 이용하여 분화된 중뇌 오가노이드에서 대뇌와 중뇌 관련 유전자의 발현을 qPCR 기법으로 조사하였다.

qPCR에 사용한 프라이머 서열은 상기 표 4에 기재되어 있다.

그 결과 도 9에 나타난 것과 같이, 2, 2.5, 또는 3 uM 농도의 CHIR99021이 처리된 경우 대뇌 관련 유전자는 억제되고 중뇌 특이적 유전자의 발현이 증가함을 확인하였다.

실험예 2-3. 대뇌 및 중뇌 관련 유전자의 발현 분석

실시예 1, 실시예 4 내지 7 및 비교예 2와 같은 방법을 이용하여 분화된 중뇌 오가노이드를 RNA sequencing기법을 이용하여 유전자의 발현을 분석하였다.

그 결과 도 10에 나타난 것과 같이, 2 내지 3 uM 농도의 CHIR99021를 처리했을 때 대뇌 관련 유전자들의 발현은 완전히 차단되고 중뇌 관련 유전자의 발현이 높은 수준으로 활성화 됨을 확인할 수 있었다.

실험예 2-4. 면역조직학 분석

실시예 1, 실시예 4 내지 7 및 비교예 2와 같은 방법을 이용하여 분화된 중뇌 오가노이드내 중뇌 도파민성신경세포의 분포를 조사하기 위하여 면역조직학 분석을 실시하였다.

면역조직한 분석을 위해서 SOX2(R&D system, AF2018), TUJ1(BIOLEGEND, 801201) 및 TH(Abcam, ab152) 항체를 사용하였다.

그 결과 도 11에 나타난 것과 같이, 2, 2.5, 또는 3 uM 농도의 CHIR99021를 처리했을 때 많은 수의 중뇌 도파민성신경세포가 균질하게 존재함을 확인할 수 있었다.

실험예 2-5. 중뇌 오가노이드의 구조적 성숙도 및 균질성 분석

실시예 7과 같은 방법을 이용하여 분화된 조직의 중뇌 오가노이드의 구조적 성숙도 및 균질성을 확인하기 위해서 공초점현미경을 이용하여 분석하였다.

공초점현미경을 이용하여 관찰하기 위해서 FOXA2(Abcam, ab108422), ASCL1(BD Pharmingen, 556604), LRTM1(Cusabio, CSB-PA884513LA01HU), LMX1A(SANTA CRUZ, sc-54273), DAT(Millipore Merck, MER-MAB369), MAP2(Millipore Merck, 05-346) 및 TH(Abcam, ab152) 항체를 사용하였다.

그 결과 도 12에 나타난 것과 같이, 3 uM의 CHIR99021를 처리했을 때 사람의 중뇌와 유사하게 뇌실대(ventricular zone), 중간대(intermediate zone), 변연대(marginal zone)로 구성된 성숙한 층상구조 (laminated structure)를 가지고 있음을 확인하여 도파민성신경세포의 균질한 분포를 통해 3 uM의 CHIR99021를 처리한 중뇌 오가노이드가 매우 균질한 구조를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 2-6. 중뇌 오가노이드의 구조적 균일성 및 성숙도 분석

실시예 7과 같은 방법을 이용하여 분화된 조직의 중뇌 오가노이드의 구조적 균일성 및 성숙도을 확인하기 위해서 전자현미경 분석을 실시하였다.

그 결과 도 13에 나타난 것과 같이, 3 uM의 CHIR99021를 처리했을 때 뇌실대 (ventricular zone)에는 신경줄기세포들이 존재하고 변연대(marginal zone)에는 신경세포들이 존재하여 사람의 중뇌와 유사한 구조성을 가짐을 확인할 수 있었다.

실험예 2-7. 중뇌 오가노이드의 기능성 분석

실시예 7과 같은 방법을 이용하여 분화된 조직의 중뇌 오가노이드의 기능성을 확인하기 위해서 HPLC 분석을 통해 도파만의 생성을 분석하였다.

그 결과 도 14에 나타난 것과 같이, 3 uM의 CHIR99021를 처리했을 때 도파민 생성이 매우 높은 수준으로 이루어져 3 uM의 CHIR99021의 처리를 통해 생산된 중뇌 오가노이드가 높은 기능성을 가짐을 확인할 수 있었다.

실험예 2-8. 중뇌 오가노이드의 기능성 분석

실시예 7과 같은 방법을 이용하여 분화된 조직의 중뇌 오가노이드의 기능성을 확인하기 위해서 패치 클램프 기록(patch-clamp recording)을 통해 전기생리학적 분석을 실시하였다.

그 결과 도 15에 나타난 것과 같이, 3 uM의 CHIR99021를 처리했을 때 신경세포의 활동전위(action potential)이 관찰되어 전기생리학적으로 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.

실험예 2-9. 중뇌 오가노이드의 기능성 분석

실시예 7과 같은 방법을 이용하여 분화된 조직의 중뇌 오가노이드의 기능성을 확인하기 위해서 뉴로멜라닌의 생성을 분석하여 3 uM의 CHIR99021를 처리했을 때 중뇌 오가노이드 전반에 걸쳐 매우 균질하게 뉴로멜라닌이 생성됨을 확인할 수 있었고(도 16 왼쪽), 뉴로멜라닌의 경우 중뇌 특이적으로 생성되기 때문에 대뇌 중뇌와의 비교분석을 통해서, 대뇌 오가노이드에서는 생성되지 않는 뉴로멜라닌이 만들어진 중뇌 오가노이드에서만 특이적으로 생성됨을 확인고(도 16 가운데), 또한, 전자한미경 사진을 통해서 중뇌 오가노이드에서 전반적인 뉴로멜라닌 과립을(도 16 오른쪽)확인하였다.

실험예 3. 분화시킨 중뇌 오가노이드의 파킨슨 질환 모델링

파킨슨 질병은 주로 중뇌 도파민 뉴런의 세포 사멸로 인해서 발병함이 알려져 있으나, 환자의 뇌에서 선택적인 세포 사멸이 발생하는 자세한 기전에 대해서는 명확히 밝혀져 있지 않다. 파킨슨 질병의 발병기전을 밝히기 위한 연구를 위해서 본 기술을 이용하여 제조된 중뇌 오가노이드가 파킨슨 질병 모델로 유용하게 사용될 수 있는지 여부를 확인하기 위해서 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 7과 같은 방법을 이용하여 분화된 조직의 중뇌 오가노이드가 파킨슨 질병의 모델로 기능할 수 있는지 여부를 확인하기 위해서 실시예 7과 같은 방법을 이용하여 분화된 조직의 중뇌 오가노이드를 8주간 배양한 후 약 2일간 0, 10, 50, 또는 100 uM MPTP를 처리하여 중뇌 도파민성신경세포의 선택적 사멸 여부를 면역염색기법으로 분석(도 17, 18, 19) 하였다.

면역염색기법으로 분석하기 위해서 TUNEL assay(Abcam, ab66108), TUJ1(BIOLEGEND, 801201), Caspase-3(CELL SIGNALING, 9661s), GABA(SIGMA, A2052), AQP4(Merck millipore, AB2118), PLP(Cusabio, CSB-PA018202LA01HU) 및 TH(Abcam, ab152) 항체를 사용하였다.

그 결과 도 17과 18에 나타난 것과 같이 실시예 7과 같은 방법을 이용하여 분화시킨 중뇌 오가노이드는 MPTP 처리시 MPTP의 농도가 증가됨에 따라 중뇌 도파민성신경세포의 사멸이 증가하였지만(도 17 및 18), 도 19에 나타난 것과 같이 실시예 7과 같은 방법을 이용하여 분화시킨 중뇌 오가노이드는 MPTP 처리시 중뇌 도파민성신경세포 이외의 다른 세포의 사멸은 관찰되지 않아 MPTP의 효과가 중뇌 도파민성신경세포에 특이적임을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 중뇌 오가노이드의 파킨슨병 질환모델로써 활용 가능성을 제시한다.

<110> Organtech <120> METHOD OF PRODUCTION FOR MIDBRAIN OGARNOID <130> SP19-0111KR <160> 37 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Noggin protein <400> 1 Met Gln His Tyr Leu His Ile Arg Pro Ala Pro Ser Asp Asn Leu Pro 1 5 10 15 Leu Val Asp Leu Ile Glu His Pro Asp Pro Ile Phe Asp Pro Lys Glu 20 25 30 Lys Asp Leu Asn Glu Thr Leu Leu Arg Ser Leu Leu Gly Gly His Tyr 35 40 45 Asp Pro Gly Phe Met Ala Thr Ser Pro Pro Glu Asp Arg Pro Gly Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Ala Ala Gly Gly Ala Glu Asp Leu Ala Glu Leu Asp Gln 65 70 75 80 Leu Leu Arg Gln Arg Pro Ser Gly Ala Met Pro Ser Glu Ile Lys Gly 85 90 95 Leu Glu Phe Ser Glu Gly Leu Ala Gln Gly Lys Lys Gln Arg Leu Ser 100 105 110 Lys Lys Leu Arg Arg Lys Leu Gln Met Trp Leu Trp Ser Gln Thr Phe 115 120 125 Cys Pro Val Leu Tyr Ala Trp Asn Asp Leu Gly Ser Arg Phe Trp Pro 130 135 140 Arg Tyr Val Lys Val Gly Ser Cys Phe Ser Lys Arg Ser Cys Ser Val 145 150 155 160 Pro Glu Gly Met Val Cys Lys Pro Ser Lys Ser Val His Leu Thr Val 165 170 175 Leu Arg Trp Arg Cys Gln Arg Arg Gly Gly Gln Arg Cys Gly Trp Ile 180 185 190 Pro Ile Gln Tyr Pro Ile Ile Ser Glu Cys Lys Cys Ser Cys 195 200 205 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog_F <400> 2 tgcaacctga agacgtgtga 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog_R <400> 3 ctatgaggga tgggagga 18 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4_F <400> 4 gacaggggga ggggaggagc tagg 24 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4_R <400> 5 cttccctcca accagttgcc ccaaac 26 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2_F <400> 6 agactgcaca tgagccagca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2_R <400> 7 cgtctccagc cagcttcaac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Otx2_F <400> 8 ccctcactcg ccacatctac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Otx2_R <400> 9 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19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BOK_R <400> 19 tgctgaccac acacttgagg ac 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAX_F <400> 20 tgctgacgtg gacacggact 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAX_R <400> 21 ccagccaccc tggtcttgga 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAD_F <400> 22 tcggagtcgc cacagttcgt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAD_R <400> 23 gcgctctttg ggcgaggaag 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRTM_F <400> 24 ctgccatgcc cttcgtgtgt 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRTM_R <400> 25 aacacttgtc cgggcagctg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAT_F <400> 26 cgccactggc tcaaggtgta 20 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DAT_R <400> 27 ccggcacgga aaggtgtaa 19 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TH_F <400> 28 ctgagattcg ggccttcgac 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TH_R <400> 29 tgcacctagc caatggcact 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMX1B_F <400> 30 ggcatcaaga tggaggagca 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMX1B_R <400> 31 tggtgagggc ttgctgacac 20 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMX1A_F <400> 32 aaagcgcgat cgacacctc 19 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMX1A_R <400> 33 tcccggtaga agcaggtggt 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASCL1_F <400> 34 ggtgatcgca caacctgcat 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASCL1_R <400> 35 gttctgagcg cttcccgttt 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX3_F <400> 36 tttccgtttc gccttcacct 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX3_R <400> 37 acgatcttgt ggcggatgtg 20

1. SMAD 억제제를 유효성분으로 포함하는 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물.
   

2. 제1항에 있어서, 상기 SMAD 억제제는 6-[4-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]phenyl]-3-(4-pyridinyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine dihydrochloride(Dorsomorphin), 4-[6-(4-piperazin-1-ylphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline(LDN193189), 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide(SB431542), 3-(6-methylpyridin-2-yl)-N-phenyl-4-quinolin-4-ylpyrazole-1-carbothioamide(A83-01) 및 Noggin 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물.
   

3. 제1항에 있어서, 상기 SMAD 억제제는 6-[4-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]phenyl]-3-(4-pyridinyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine dihydrochloride(Dorsomorphin) 및 3-(6-methylpyridin-2-yl)-N-phenyl-4-quinolin-4-ylpyrazole-1-carbothioamide(A83-01)인 것을 특징으로 하는, 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물.
   

4. 제1항에 있어서, 상기 도르소모핀(Dorsomorphin)은 1 uM 내지 2 uM의 농도인 것을 특징으로 하는, 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물.
   

5. 제1항에 있어서, 상기 LDN193189은 50 nM 내지 100 nM의 농도인 것을 특징으로 하는, 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물.
   

6. 제1항에 있어서, 상기 SB431542은 5 uM 내지 10 uM의 농도인 것을 특징으로 하는, 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물.
   

7. 제1항에 있어서, 상기 A83-01은 1 내지 2 uM의 농도인 것을 특징으로 하는, 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물.
   

8. 제1항에 있어서, 상기 Noggin 단백질은 100 ng/ml 내지 200 ng/mL의 농도인 것을 특징으로 하는, 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물.
   

9. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic stem cell), 또는 유도만능줄기세포(induced Pluripotent stem cell)인 것을 특징으로 하는, 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물.
   

10. 제1항에 있어서, 6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile(CHIR99021)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물.
    

11. 제10항에 있어서, 상기 CHIR99021는 0.8 uM 내지 3 uM의 농도인 것을 특징으로 하는, 줄기세포를 중뇌 오가노이드로 분화 유도하기 위한 배지 조성물
    

12. 줄기세포를 SMAD 억제제를 포함하는 배지 조성물에서 배양하여 중뇌로 분화키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 중뇌 오가노이드 제조방법.
    

13. 제12항에 있어서, 상기 SMAD 억제제는 6-[4-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]phenyl]-3-(4-pyridinyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine dihydrochloride(Dorsomorphin), 4-[6-(4-piperazin-1-ylphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline(LDN193189), 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide(SB431542), 3-(6-methylpyridin-2-yl)-N-phenyl-4-quinolin-4-ylpyrazole-1-carbothioamide(A83-01) 및 Noggin 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 중뇌 오가노이드 제조방법.
    

14. 제12항에 있어서, 6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile(CHIR99021)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 중뇌 오가노이드 제조방법.
    

15. 제12항 내지 제14항중 어느 한 항의 제조방법에 의해서 제조된 중뇌 오가노이드.